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猪链球菌作为一种重要的人畜共患病病原,已经越来越严重地危害到养殖业发展和人类生命健康安全。,由于其血清型众多,且不同型之间的交叉保护力差和菌株的变异性,到目前为止,对于该病原菌的防治依然缺乏有效的疫苗。尽管目前已有商品化的灭活疫苗,但是由于其仍然存在诸多缺点,如存在免疫副反应、不能提供广谱的免疫保护等,因此急需筛选鉴定出具有很好免疫原性,且通用型的亚单位疫苗候选抗原,并对这些蛋白的免疫机理进行研究,为深入揭示猪链球菌2型的致病与免疫机理奠定基础。本研究选取了猪链球菌2型6个具有免疫原性的蛋白(分别是SSU0434、 SSU0482、 SSU0927、 SSU1634、 SSU1637和SSU1853),进行免疫效果的研究,通过基因克隆,蛋白表达纯化后进行蛋白免疫效果的研究,旨在选取出免疫原性好,保护力较高的疫苗候选抗原,为开发新型的、有效的猪链球菌疫苗奠定基础。主要研究内容如下：1.SSU0434、SSU0482、 SSU0927、 SSU1634、 SSU1637和SSU1853蛋白的克隆、表达、纯化参照P1/7基因组序列设计引物,以猪链球菌SC19基因组为模版扩增基因(经同源比对,目的基因同源性均为100%),构建SSU0434、 SSU0482、 SSU0927、 SSU1634、 SSU1637和SSU1853的原核表达载体。经测序正确后,转入大肠杆菌DE-3中,进行蛋白表达。将表达正确的蛋白,大量诱导表达并纯化,以备下一步实验用。2.6个膜相关蛋白SSU0434、 SSU0482、 SSU0927、SSU1634、SSU1637和SSU1853对小鼠免疫保护力评价将上述表达纯化的蛋白免疫小鼠,每组6只,二免后14天用SC19菌株,通过腹腔注射的方法,以2×109CFU/只的剂量攻毒,攻毒后观察14天。结果表明,6个蛋白对小鼠的保护力分别为83.3%,83.3%,33.3%,66.7%,50%和83.3%。选出保护力较高的SSU0434、 SSU0482和SSU1853进一步对其免疫原性和免疫保护力进行研究。3.SSU0434、 SSU0482和SSU1853单个蛋白和组合蛋白的的免疫原性和免疫保护力研究Western-blot结果显示,SSU0434、SSU0482、口SSU1853三个蛋白均能引起小鼠产生特异性免疫反应。将表达纯化的SSU0434、SSU0482、 SSU1853和SSU0434—SU0482—SU1853蛋白免疫4周龄的Babl/C雌性小鼠,二免后14天攻毒,连续观察14天,统计存活率分别为60%、50%,60%和40%。用MTS方法做淋巴细胞增殖实验,测OD490nm。SSU0434和SSU0482蛋白均能刺激其免疫组小鼠脾脏的淋巴细胞增殖,而SSU1853蛋白不能刺激其免疫组小鼠脾脏的淋巴细胞增殖。将上述脾细胞培养48-72h后,收集细胞上清,检测细胞因子IFN-γ和IL-6,与对照组相比,IFN-γ和IL-6水平显著升高,说明小鼠体内同时发生了Thl型和Th2型免疫反应。SSU0434、SSU0482、SSU1853和SSU0434-SSU0482-SSU1853均能刺激产生小鼠特异性的高滴度抗体,且IgG1和IgG2a抗体水平差异不显著,说明小鼠体内同时发生了Thl型和Thl型免疫反应。4.SSU0434、SSU0482和SSU1853单个蛋白或3个蛋白组合后免疫血清被动免疫实验每只小鼠注射100μL的免疫血清(分别是3个蛋白单免疫和组合免疫后的血清),每组8只小鼠,24小时后攻毒SC19菌株。连续观察14天,SSU0434、SSU0482、SSU1853和SSU0434—SU0482—SU1853保护力分别为87.5%、75%、62.5%,50%,说明在小鼠对SS2特异性的抵抗力中,SSU0434,SSU0482、SSU1853和SSU0434—SU0482—SSU1853的特异性抗体可能起到一定的作用。5.SSU0434、SSU0482和SSU1853单个蛋白或3个蛋白组合后免疫血清的杀菌实验将各组蛋白的免疫血清(分别是3个蛋白单免疫和组合免疫后的血清)951μL,95μL无菌PBS,空白小鼠全血100μL,105CFU的SC19菌株共孵育后,计数,统计杀菌效率。结果显示,免疫血清不能起到杀菌作用,可能是血清中的抗体不能与细菌作用,而是小鼠血液中的吞噬细胞,中性粒细胞等非特异性成分发挥杀菌作用。