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微孢子虫(Microsporidia)是一类细胞内专性寄生的单细胞真核微生物,其寄主范围十分广泛,几乎可以感染从无脊椎动物到脊椎动物在内的所有动物。微孢子虫感染可引起家蚕微粒子病、蜜蜂种群崩坏综合征、对虾生长缓慢综合征等,给全球的养殖业带来了了巨大的经济损失。微孢子虫的生活史一般分为感染期(环境期)、裂殖增殖期及孢子形成期。感染期是微孢子虫生活史中唯一的细胞外阶段,该时期的成熟孢子在外界条件刺激下,极管外翻弹出,将侵染性孢原质沿极管输入至宿主细胞中,从而完成侵染。微孢子虫的侵染机制在自然界十分独特,但其分子机制一直尚未阐明,因此这一问题也是微孢子虫学界的重大科学问题。类枯草杆菌蛋白酶(subtilisin-like protease,SLP)作为病原微生物的毒力因子,可参与真菌侵染结构——附着胞的形成,也可水解加工底物促进病原的释放。本研究室前期研究发现家蚕微粒子虫类枯草杆菌蛋白酶NbSLP1定位于孢子极管弹出的位置,且锚定盘-孢壁复合体蛋白NbSWP16能够与NbSLP1相互作用,推测NbSLP1可能通过水解锚定盘区域的NbSWP16促进极管弹出。为了验证这一假说,我们对NbSLP1开展了全面研究:首先,构建了大肠杆菌重组表达菌株E.coli Transsetta[pET30-pro-Nbslp1],利用Pull-down结合质谱及蛋白质N-端测序技术鉴定了 NbSLP1在大肠杆菌中的自剪切及其剪切位点,探索NbSLP1催化域的表达条件,通过酶解实验及细胞内共表达分析NbSLP1与NbSWP16之间的酶解关系。主要研究结果如下:1.NbSLP1自剪切及其剪切位点鉴定类枯草杆菌蛋白酶具有抑制结构域和催化结构域,普遍存在自剪切现象,通过自剪切去除抑制结构域产生具有催化活性的成熟酶。本部分利用大肠杆菌表达系统,探究NbSLP1的自剪切特征及剪切基序。采用PCR技术克隆了Nbslp1去信号肽的基因序列,构建表达载体p ET30-pro-Nbslp1,进而转化大肠杆菌表达菌株E.coli Transsetta(DE3),利用Pull-down技术,从诱导菌株中分离、纯化重组表达的His-pro-NbSLP1-His蛋白。聚丙烯酰胺凝胶电泳(S DS-PAGE)结果显示获得～50 kDa和～15 kDa两个蛋白条带,其分子量分别与NbSLP1的Pe ptidase_S8催化域及Inhibitor_I9结构域大小相当。经LC/MS-MS检测均鉴定为NbSLP1,说明NbSLP1在大肠杆菌中发生了自剪切。进一步对～50 kDa蛋白条带进行N-端序列分析,结果显示其N-端序列为Asp-Phe-Asn-Leu-Ser-Asp-Tyr-Arg-Lys-Lys,从而确定了自剪切位点P4～P4,为 Met101-Arg102-Ile103-Ala104-Asp105-Phe106-Asn107-Leu108。同时依此,也确定了 NbSLP1成熟酶长度为388 aa,分子量为42.8 kDa;而NbSLP1-Inhibitor_I9结构域的长度为77 aa,分子量为8.8 kDa。设计定点突变引物,利用overlap PCR的方法将自剪切位点I103A104D105定点突变为A103A104A105,并构建重组表达载体pET30-Nbslp1mut。检测重组菌表达情况,结果显示突变体蛋白His-NbSLP1mut-His仍存在自剪切,但剪切效率受到一定影响。2.NbSLP1活性蛋白酶制备为鉴定NbSLP1的底物,需制备NbSLP1活性蛋白。本研究设计了Nbslp1-Peptidase_S8(Nbslp1S8)特异的引物,利用PCR扩增并构建pET30-Nbslp1S8表达载体,转化E.coli Transsetta表达菌株,在16℃ 80 r/min条件下,0.3 mM IPTG诱导重组菌表达蛋白His-NbSLP1S8-His,利用亲和层析的方法纯化并对重组蛋白His-NbSLP1S8-His柱上复性,经福林酚法检测显示其酶活极低。为了获得具有更高活性的NbSLP1成熟酶,重新采用了 NbSLP1自剪切的表达菌株 E.coli Transsetta[pET30-pro-Nbslp1],于 16℃ 80 r/min 条件下,0.2 mM IPTG 诱导表达 20 h,并通过亲和层析纯化获得了 NbSLP1C-His,但其中包含His-NbSLP1I9抑制结构域多肽;除盐后获得较纯重组蛋白NbSLP1C-His,样品在30℃条件下消化1 h,结果显示较纯的NbSLP1C-His酶活力经福林酚法检测为236.86 U/g,而Inhibitor_I9结构域可抑制NbSLP1成熟酶的酶活。3.NbSLP1的底物分析基于NbSLP1原核表达及酶活检测,获得了 NbSLP1的活性蛋白酶。将其与NbSWP16体外孵育,并利用鼠源anti-His抗体进行免疫印迹分析。结果显示,与对照组相比,孵育后NbSLP1C-His与NbSWP16无明显差异条带,即未发现NbSLP1水解NbSWP16。进一步将重组质粒 pET30-pro-Mbslp1 及 pET-DsbA-Nbswp16 共转化大肠杆菌表达菌株 E.coli Transsetta中,在大肠杆菌体内验证其酶解关系,免疫印迹分析结果与共孵育实验结果类似,也不能说明NbSLP1与NbSWP16存在酶与底物的水解关系。最后利用NbSLP1自剪切位点MRIA104↓D105FNL,预测微孢子虫SLP1保守的自剪切位点,并分析SLP1剪切位点的基序偏好性,结果显示脑炎微孢子虫属P4-P3’自剪切位点均较保守,微粒子虫属P4,P2,P1位点相对保守。并以此在家蚕微粒子虫蛋白质数据库中做了进一步筛选,以寻找其潜在底物。综上,本论文鉴定了 NbSLP1的自剪切位点,并获得了具有活性的成熟蛋白酶,但未能证明位于锚定盘的NbSWP16是NbSLP1的底物。我们已经依据鉴定的自剪切位点特征找到一些新的候选底物,后续,我们将继续研究NbSLP1的底物及其在微孢子虫极管弹出中的作用。