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木糖醇因其甜度高、热量低且代谢不受胰岛素影响等特性而备受关注,在食品、医药和化工等领域得到广泛应用,在国际市场上供不应求。近年来,随着绿色发展和可持续发展理念越来越深入人心,人们的环保意识增强,生物法生产木糖醇逐渐成为各国学者开展研究的重点。D-阿拉伯糖醇脱氢酶(D-arabitol dehydrogenase,ArDH)和木糖醇脱氢酶(xylitol dehydrogenase,XDH)作为木糖醇生物合成途径中的关键酶和限速酶,它们的高效表达对D-阿拉伯糖醇转化生产木糖醇起着至关重要的作用。因此,构建高性能的基因工程菌,对于木糖醇生产效率的提高以及工业化生产具有重要的意义。本论文利用PCR技术从泰国葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter thailandicus)中扩增出ArDH的编码基因ardh,构建重组质粒pET28a-ardh,并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中得到了高效表达;ardh的表达产物经SDS-PAGE分析显示有27kDa特异性蛋白条带出现,纯化蛋白并测定其酶学性质。当以D-木酮糖为底物时,还原反应的最适温度为30℃,最适pH约为5.0,还原反应的比活为11.46U/mg,对D-木酮糖的Km值为27mmol/L,Vmax为22.3μmol/min/mg;当以D-阿拉伯糖醇为底物时,氧化反应最适温度为30℃,最适pH约为9.0,氧化反应的比活为27.72U/mg,对D-阿拉伯糖醇的Km值为12.5mmol/L,Vmax为52.8μmol/min/mg。同时,克隆并表达了来自G.thailandicus的XDH的编码基因xdh,构建重组质粒pET28a-xdh,并在大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中得到了高效表达。SDS-PAGE分析结果显示重组菌BL21(DE3)-xdh有28kDa特异性蛋白条带出现。经过金属镍亲和层析及Sephacryl S-300凝胶层析纯化后,系统地测定其酶学性质。当以D-木酮糖为底物时,还原反应的最适温度为30℃,最适pH约为5.0,还原反应的比活为126.3U/mg,对D-木酮糖的Km值为11.2mmol/L,Vmax为134.2μmol/min/mg;当以木糖醇为底物时,氧化反应最适温度为35℃,最适pH约为11.0,氧化反应的比活为28.6U/mg,对木糖醇的Km值为78.6mmol/L,Vmax为53.6μmol/min/mg。利用重组质粒pET28a-xdh和pET28a-ardh构建重组质粒pET28a-xdh-ardh,并转入E.coli BL21(DE3),实现了xdh和ardh基因的协同表达。对重组菌BL21(DE3)-xdh-ardh和原始菌G.thailandicus分别进行摇瓶发酵,发酵结果表明重组菌BL21(DE3)-xdh-ardh的木糖醇产量为23.7 g/L,原始菌G.thailandicus的木糖醇产量为12.9 g/L。重组菌从D-阿拉伯糖醇到木糖醇的转化率为29.6%,相较于原始菌从D-阿拉伯糖醇到木糖醇的转化率16.1%有较大提高。