羊口疮（Orf）是由羊口疮病毒（OrfVirus,OrfV）引起绵羊、山羊发生以口唇、舌、鼻、乳房等部位皮肤、黏膜形成丘疹、脓疱、溃疡以及结成疣状厚痂为主要特征的人兽共患病。OrfV是有囊膜线性双链DNA病毒,G+C含量约64%,其基因组由中间编码区和位于两末端的反向重复序列组成,中央编码区非常保守。B2L、F1L基因位于羊口疮病毒第11、59个完整开放阅读框,高度保守,分别编码42 kD、39 kD蛋白,二者均能引起机体产生免疫应答,是羊口疮新型疫苗研究中两个重要免疫原性基因。DNA疫苗作为一种崭新的疫苗,因没有毒力返强作用,制备简单、稳定性好、贮存和运输方便等优点而被国内外学者广泛关注。本研究采用SOE-PCR技术将OrfV B2L基因和F1L基因进行融合,构建真核表达重组质粒pVAX1-B2L-F1L,并免疫昆明系小鼠后检测其免疫指标,评价pVAX1-B2L-F1L诱导小鼠产生的免疫效果,以期为OrfV基因工程疫苗研制提供新思路。1.SOE-PCR技术扩增OrfV B2L和F1L基因本研究在B2L基因的下游引物和F1L基因的上游引物分别插入一段编码（G₄）S₂多肽的碱基linker,通过SOE-PCR技术扩增得到OrfV融合基因B2L-F1L,克隆于pMD-18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α,经质粒PCR、双酶切及序列测定。应用生物信息学相关软件及方法,对B2L-F1L融合基因进行序列分析并对其编码蛋白进行了二级结构、亲疏水性、跨膜结构域、保守结构域和信号肽预测。结果显示,B2L-F1L融合基因PCR扩增产物大小为2181 bp,编码726个氨基酸,二级结构中α-螺旋和无规则卷曲所占比例较大,预测此氨基酸的抗原性和柔韧性较好,推测为疏水性蛋白,有两个跨膜区域,无信号肽区域。2.OrfV B2L-F1L融合真核表达质粒构建及其在MDBK细胞中的表达将羊口疮病毒B2L-F1L融合基因插入真核表达载体PVAX1,构建真核表达质粒PVAX1-B2L-F1L,经质粒PCR、双酶切和测序鉴定,将成功构建的重组质粒PVAX1-B2L-F1L转染MDBK细胞,采用RT-PCR和IFA方法对其瞬时转录、表达进行鉴定。结果显示,通过RT-PCR能检测出与目的基因大小相同的条带,通过IFA方法能在转染细胞浆中看到绿色荧光。结果表明,融合真核表达质粒PVAX1-B2L-F1L能在体外细胞中表达。3.pVAX1-B2L-F1L真核表达质粒诱导小鼠的免疫原性研究以PVAX1-IL-2为细胞因子佐剂,分别设置PVAX1-IL-2+PVAX1-B2L-F1L组、PVAX1-B2L-F1L组、PVAX1组、生理盐水组。将160只小鼠随机分成4组,40只/组,腿部肌肉注射各组小鼠,初次免疫后每周加强免疫1次,共免疫3次。免疫后4组小鼠每周进行眼球采血,每组每周采5只小鼠,共采8周,收集各组全血室温静置,分离血清,-20℃保存。眼球采血后,颈椎脱臼法处死小鼠,无菌采取脾脏,用于小鼠脾细胞增殖实验。采用ELISA方法对小鼠血清中OrfV特异性抗体和Th1型（IL-2、IFN-γ）、Th2型（IL-4、IL-6）细胞因子进行检测;MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况。结果显示,PVAX1-IL-2+PVAX1-B2L-F1L和PVAX1-B2L-F1L组在免疫小鼠1周后就能诱导其产生OrfV特异性抗体,在第5周时抗体水平最高,第6周开始呈下降趋势,检测至第8周仍为阳性,而PVAX1组和生理盐水组未检测到OrfV特异性抗体。PVAX1-IL-2+PVAX1-B2L-F1L和PVAX1-B2L-F1L组均能刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,极显著（P<0.01）高于pVAX1和生理盐水组,PVAX1-IL-2+PVAX1-B2L-F1L脾淋巴细胞增殖反应高于PVAX1-B2L-F1L组,在第2、6周极显著（P<0.01）,第5周差异显著（P<0.05）,第3、4、7、8周差异不显著（P>0.05）。pVAX1-IL-2+pVAX1-B2L-F1L和pVAX1-B2L-F1L组均能刺激小鼠机体分泌IL-2,极显著（P<0.01）高于pVAX1组和生理盐水组。pVAX1-IL-2+pVAX1-B2L-F1L组分泌IL-2量高于pVAX1-B2L-F1L组,在第1周差异显著（P<0.05）,第2⁷周差异极显著（P<0.01）,第8周差异不显著（P>0.05）;pVAX1-IL-2+pVAX1-B2L-F1L和pVAX1-B2L-F1L组均能刺激小鼠分泌IFN-γ,极显著（P<0.01）高于pVAX1和生理盐水组,第1周,pVAX1-B2L-F1L组分泌IFN-γ显著（P<0.05）高于pVAX1-IL-2+pVAX1-B2L-F1L组,第2周差异不显著（P>0.05）,第3⁸周pVAX1-IL-2+pVAX1-B2L-F1L组分泌IFN-γ极显著（P<0.01）高于pVAX1-B2L-F1L组。pVAX1-IL-2+pVAX1-B2L-F1L和pVAX1-B2L-F1L均能刺激小鼠分泌IL-4,第1⁶周均极显著（P<0.01）高于pVAX1和生理盐水组,在第1、2、6周,pVAX1-IL-2+pVAX1-B2L-F1L组分泌IL-4极显著（P<0.01）高于pVAX1-B2L-F1L组,第3周显著（P<0.05）高于pVAX1-B2L-F1L组,在第4、5、8周pVAX1-B2L-F1L分泌IL-4高于pVAX1-IL-2+pVAX1-B2L-F1L组,其中第4、8周差异显著（P<0.05）,第5周差异不显著（P>0.05）。pVAX1-IL-2+pVAX1-B2L-F1L和pVAX1-B2L-F1L均能刺激小鼠分泌IL-6,第1、2、3、6、7极显著（P<0.01）高于pVAX1和生理盐水组,在第1、2周pVAX1-B2L-F1L组分泌IL-6极显著（P<0.01）高于pVAX1-IL-2+pVAX1-B2L-F1L组,第4、5、8差异不显著（P>0.05）;第3、6、7周pVAX1-IL-2+pVAX1-B2L-F1L高于pVAX1-B2L-F1L组,差异不显著（P>0.05）。结果表明,pVAX1-B2L-F1L能诱导小鼠产生良好的免疫应答,以Th1型细胞免疫为主,且pVAX1-IL-2作为免疫佐剂能有效增强pVAX1-B2L-F1L的免疫效果。结论:本试验采用SOE-PCR技术扩增得到OrfV融合基因B2L-F1L,克隆测序进行生物学信息分析,二级结构中α-螺旋和无规则卷曲所占比例较大,预测此氨基酸的抗原性和柔韧性较好,有两个跨膜区域,无信号肽区域;将融合基因B2L-F1L插入真核表达载体PVAX1,成功构建了融合真核表达质粒PVAX1-B2L-F1L,通过RT-PCR和IFA方法证明其能在MDBK细胞中表达;以pVAX1-IL-2作为细胞因子佐剂,联合PVAX1-B2L-F1L免疫小鼠,通过ELISA方法检测小鼠血清中OrfV特异性抗体和Th1型（IL-2、IFN-γ）、Th2型（IL-4、IL-6）细胞因子,MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖情况,结果显示真核表达质粒PVAX1-B2L-F1L能够诱导小鼠产生体液免疫和细胞免疫,且pVAX1-IL-2作为免疫佐剂能够增强pVAX1-B2L-F1L对小鼠的免疫效果。