论文部分内容阅读
IL-17是重要的促炎细胞因子之一,在多种炎性反应及自身免疫性疾病病理过程中具有重要作用。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein,MCP-1)作为单核/巨噬细胞的主要趋化和激活因子,介导单核细胞向心肌组织的迁移,促进病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VMC)的发生发展。IL-17能够通过上调MCP-1的表达加重VMC心肌损伤,但其具体分子机制尚未完全阐明,如果能够减少IL-17诱导下MCP-1的表达对于减轻VMC的病变很有意义。小鼠MCP-1启动子区存在NF-κB、AP-1等转录因子结合位点,我们前期发现,在心肌细胞中IL-17可磷酸化NF-κB p65激活NF-κB上调MCP-1的表达,此外IL-17还可通过Act1/TRAF6/MAPK信号通路激活AP-1上调MCP-1的表达。但是,关于NF-κB和AP-1之间是否存在某种枢纽分子既能影响NF-κB的激活,又能调控AP-1,从而在IL-17上调心肌细胞MCP-1表达中发挥作用,目前尚不明确。转化生长因子β激活激酶1(TGF-β activated kinase-1,TAK1)是丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen activated protein kinase kinase kinase,MAP3K)家族重要成员之一。IL-17与IL-17RA结合后触发下游信号转导通路IL-17R-Act1-TRAF6,TRAF6可通过多聚化泛素链激活TAK1,活化的TAK1能够影响某些细胞中转录因子NF-κB、AP-1的活性调控下游靶基因的表达。但在心肌细胞中,IL-17能否激活TAK1调控NF-κB和AP-1上调MCP-1的表达,目前还不清楚。鉴于此,我们推测:在心肌细胞中IL-17与IL-17RA结合后可以激活TAK1,随后TAK1一方面通过激活NF-κB、磷酸化p65蛋白上调MCP-1的表达;另一方面,TAK1通过激活MAPK信号通路进而激活AP-1上调MCP-1的表达,从而加重VMC心肌病变。目的研究IL-17能否通过激活TAK1调控转录因子NF-κB和AP-1进而上调心肌细胞MCP-1的表达。方法1.差速贴壁法分离BALB/c小鼠心肌细胞,进行心肌细胞原代培养。2.Western blot检测IL-17作用不同时间后心肌细胞p-TAK1、TAK1的表达。3.设计合成三对小鼠TAK1基因的siRNA,实时荧光定量PCR方法筛选最适干扰序列和浓度,Western blot检测转染siRNA后TAK1蛋白的表达。4.分别采用q-PCR和ELISA检测TAK1 siRNA转染后IL-17作用下MCP-1 mRNA和蛋白的表达。5.Western blot检测转染TAK1 siRNA后IL-17作用下通路分子p-p65、p65、p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-c-Jun 和 c-Jun 蛋白的表达。6.使用SPSS软件分析数据,用单因素方差分析进行组间比较,组间两两比较采用LSD-t检验,检验水准α=0.05,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.IL-17刺激下心肌细胞中p-TAK1和TAK1蛋白的表达。IL-17刺激心肌细胞15min时p-TAK1表达显著增加(P<0.01),30min时p-TAK1表达有所下降(P<0.05);各时间点心肌细胞中TAK1蛋白水平与未处理组相比差异无统计学意义(P>0.05)。2.TAK1 siRNA序列和浓度的筛选。与si-NC组相比,转染TAK1 siRNA#1、TAK1 siRNA#2、TAK1 siRNA#3组TAK1 mRNA含量均有不同程度的下降(P<0.05),转染TAK1 siRNA#3组的TAK1 mRNA下降最明显。转染终浓度为10nM、30nM、50nM、100nM 的 TAK1 siRNA#3,与 control 组相比,各浓度组TAK1 mRNA 表达量均下降(P<0.05),siRNA 终浓度为 50nM 时 TAK1 mRNA表达量下降最明显(P<0.01),提示50nM的TAK1 siRNA#3沉默效果较好。3.TAK1基因沉默效果的评价。与转染si-NC组相比,心肌细胞转染si-TAK1#2和si-TAK1#3可以明显降低TAK1蛋白的表达水平(p<0.05),转染si-TAK1#3组TAK1蛋白表达降低更明显(P<0.01)。4.TAK1在IL-17诱导MCP-1 mRNA表达中的作用。转染si-TAK1组与si-NC 组比较,MCP-1 mRNA 表达量降低(P<0.05)。加入 IL-17(50ng/mL)后,MCP-1 mRNA 表达增加(P<0.01)。IL-17+si-TAK1 组与 IL-17+si-NC 组相比,MCP-1 mRNA表达量明显降低(P<0.01)。5.TAK1在IL-17诱导MCP-1蛋白表达中的作用。转染si-TAK1组与si-NC组比较,MCP-1蛋白含量明显降低(P<0.01)。加入IL-17(50ng/mL)后,MCP-1蛋白表达明显增加(P<0.01)。IL-17+si-TAK1组与IL-17+si-NC组相比,MCP-1蛋白表达明显降低(P<0.01)。6.干扰TAK1对IL-17诱导下NF-κB信号通路分子表达的影响。与对照组相比,IL-17刺激后p65的磷酸化水平增加(P<0.05)。与转染si-NC组相比,转染si-TAK1能够抑制IL-17诱导的p65磷酸化(P<0.05)。7.干扰TAK1对IL-17诱导下AP-1信号通路分子表达的影响。与对照组相比,IL-17刺激后p38、JNK、c-Jun的磷酸化水平显著增加(P<0.01)。与转染si-NC组相比,转染si-TAK1能够抑制IL-17诱导的p38、JNK和c-Jun的磷酸化(P<0.05)。结论1.IL-17可以通过诱导TAK1的磷酸化上调心肌细胞MCP-1的表达。2.干扰TAK1能够抑制IL-17刺激下NF-κB、AP-1信号通路的活化及MCP-1的表达。