研究背景与目的免疫分析方法是指利用抗原与抗体之间的特异性结合反应实现对相对应的抗体、抗原或是相关物质进行定性或定量检测的分析方法。免疫分析被广泛地应用于食品及环境分析,生物及医学研究,临床诊断等领域。免疫分析技术根据待测物是否悬浮在分析样品中的不同,分为均相与非均相(或固相)。目前免疫分析主要以微孔板为实验平台的非均相分析模式。一般而言,非均相分析(如ELISA,TRFIA)整个操作过程步骤多,缓慢的异相免疫反应体系,多次洗涤来分离结合标记与游离标记,耗费时间长,不易自动化等缺点。因此,这种方法不能满足某些快速检测和诊断的要求。而相反,均相免疫分析不需要分离,能够直接识别和测定免疫反应样品中的待测物(抗体或者抗原),比较容易实现微型化和自动化。均相免疫分析避免了因为冲洗带来的检测不稳定性和低灵敏度,更大大提高了检测效率,适宜开发快速高通量自动化检测技术。甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)是一种单链多肽糖蛋白,也是一种主要在胎儿发育过程中卵黄囊和肝脏分泌的血浆白蛋白。甲胎蛋白浓度峰值是在胎儿时期,随后在8-12个月逐渐降低,可降至健康成人水平,以后在没有疾病的情况下,终生将维持低水平。监测孕妇血中甲胎蛋白浓度常作为胎儿畸形的筛选指标。由于肝细胞癌、卵黄囊和胚胎性肿瘤及部分肝外肿瘤可重新合成甲胎蛋白。因此在临床上,AFP常用于原发性肝癌或是非肝癌(包括消化、呼吸、泌尿生殖等多系统器官恶性肿瘤)的检测指标。其次,AFP常用于肝炎、肝硬化等急慢性肝病诊断、病情监测。此外临床上还常联合其他检测方法用于出生缺陷的产前筛查、胚胎瘤、母细胞瘤诊断。以期到达早期识别疾病,有助于减少死亡率、改善存活率和大力普及优生优育。量子点(Quantum dots, QDs)又称半导体纳米颗粒,由于其具有宽激发谱、窄发射峰、多色性及抗光漂白性等诸多优点,使其成为重要的荧光标记物用于现代均相免疫分析技术中。研究内容与方法本文旨在利用半导体材料量子点(Quantum dots, QDs)微球作为标记探针,并结合稀土金属螯合物铽(Luminescent terbium chelates, LTCs)的时间分辨荧光,在荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理下,对荧光共振能量转移供体(Donor)与受体(Receptor)的表面进行处理,以甲胎蛋白(AFP)为例,建立一种高灵敏度、低信噪比的均相免疫分析法。主要研究工作包括如下三个方面：1、量子点微球的制备。为了能将硒化镉/硫化锌(CdSe/ZnS)量子点运用到本课题中,我们采用量子点高通量编码惯用的方法：羧基化聚苯乙烯微球(Carboxyl-functionalized polystyrene microspheres, CPs)经过三氯甲烷/异丙醇的溶胀,包埋脂溶性量子点,进而制得本研究所需的表面羧基功能化的量子点聚苯乙烯微球(QPs)。同时,所制备得到的表面功能化的荧光复合微球具有高荧光强度,并能够在常用PBS缓冲溶液中稳定地贮存4℃。2、铽螯合物的合成。运用原始化学材料二乙三胺五乙酸二酐(DTPA,A), TbCl3, CS124来合成铽螯合物配体ITC-DTPA-Tb3+。3、对荧光共振能量转移受体(Donor)与受体(Receptor)进行表面化学修饰,以期消除非特异性吸附或防止聚集沉淀。一方面,聚苯乙烯微球(CPs)本身就是一种非特异性极强的物质,尽管其表面进过了羧基的水溶性修饰,但经过了三氯甲烷／异丙醇的多次溶胀而吸附脂溶性量子点后,其亲水表面已部分破坏。这样的话,其非特异性吸附能力极大,尤其是在检测抗原或抗体时候表现出来,对实验结果造成极大影响。另一方面,铽螯合物供体本身是一个多羧酸基和酯基团的螯合剂与铽金属离子(Tb3+)形成的,具有水溶胶性质,表面富有的阴离子同电荷静电排斥力促使铽螯合物很难与受体或生物分子学发生非特异性吸附或聚集,其表面已排除了非特异性吸附的可能。因此,本研究的还要对量子点纳米微球表面进行化学修饰,使其尽可能多的带有亲水基团,从而避免非特异性吸附。4、利用双抗体夹心法,在荧光共振能量转移(FRET)原理下,羧基聚苯乙烯量子点微球(QPs)和铽螯合物(LTCs)分别标记两株AFP单克隆抗体之后,建立双抗体夹心模式的定量测定AFP标准品中AFP的均相免疫分析法。研究结果：采用双抗体夹心法模式,充分利用两株抗体与AFP抗原的相互作用,从而验证QPs、LTCs两者与抗体偶联的生物活性,并研究QDs用于均相荧光共振能量转移(HTR-FRET)免疫分析中的可行性与实用性。结果表明,LTCs与QPs之间能够发生能量转移,其荧光共振能量转移信号与AFP浓度成线性相关,其工作曲线为LogY=3.65786+0.43863·log X(R=0.996,P<0.01),并计算出其分析灵敏度为0.4ng/mL。该新型均相荧光免疫分析方法具有不需冲洗掉游离荧光标记物,灵敏度高等优势,为今后实现快速便捷、多通道、高灵敏度、微量化、自动化及高通量化的生物医学传感技术和现代免疫分析技术提供科学依据。研究结论：本论文以稀土螯合物LTCs作为能量供体标记一株AFP单抗,QPs作为能量受体标记另一株AFP单抗,建立了一种基于时间分辨FRET的均相免疫分析定量检测甲胎蛋白的方法。该方法操作简便,耗时较短(反应时间约45min),且其线性范围较宽(0.4～960ng/mL),可用于AFP抗原的筛选。