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背景弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B-cell Lymphoma,DLBCL)是恶性淋巴瘤中最常见的亚型,约占所有成人非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin Lymphoma,NHL)的30%~40%,其形态学、遗传学特征、免疫表型、临床表现、对治疗的反应及预后具有明显的异质性。利妥昔单抗作为B细胞淋巴瘤治疗史上的一个重大突破,显著提高了患者的缓解率和生存率,但仍有超过30%的DLBCL患者对利妥昔单抗免疫化疗存在原发或者继发耐药,急需新型治疗方法改善预后。表观遗传学主要通过改变对DNA和组蛋白的修饰来调控基因的表达,异常的表观遗传修饰将导致肿瘤的发生。研究发现,组蛋白乙酰基转移酶(histone acetyltransferase,HATs)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDACs)的失衡,引起与细胞周期阻滞、受损细胞凋亡、细胞分化、肿瘤免疫等有关的基因表达受到抑制,促使肿瘤的发生。在DLBCL中,约有30%的患者存在组蛋白乙酰基转移酶CREBBP和/或EP300的灭活突变,与DLBCL的发生和进展存在密切关系。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACis)通过干扰HDACs的功能,增加细胞内组蛋白的乙酰化程度,抑制肿瘤细胞增殖,诱导肿瘤细胞发生凋亡和细胞周期阻滞,产生抗肿瘤效应。西达本胺(Chidamide)是我国自主设计和制造的新一代酰胺类HDACis,能够选择性地抑制HDAC1、2、3、10的表达,已获准应用于复发及难治性外周T细胞淋巴瘤的治疗,并且在白血病、结直肠癌等恶性肿瘤中也显示出了一定的疗效,但其对dlbcl的作用尚不清楚。本研究中,我们通过西达本胺对dlbcl的体外实验,明确其对dlbcl细胞的作用,并初步探讨不同体外作用的内在机制,寻找提高西达本胺治疗dlbcl疗效的新方法。目的明确西达本胺对dlbcl细胞凋亡、周期和分化的影响,初步探讨不同体外作用的内在机制,寻找提高西达本胺治疗dlbcl疗效的新方法。材料和方法1.细胞培养与传代:选取增殖特性不同的三种dlbcl细胞株:oci-ly3、oci-ly7和oci-ly8,分别培养传代。2.annexinv-fitc/pi双染流式细胞术检测不同种类药物及药物浓度作用48h后的细胞凋亡率。3.流式细胞术检测不同浓度西达本胺作用24h后的细胞周期。4.westernblot法检测cd20、cd38、cd138、h3和ac-h3的蛋白表达水平。5.采用spss13.0软件进行统计学分析,p<0.05为差异有统计学意义。结果1.oci-ly3、oci-ly7和oci-ly8细胞具有不同的增殖特性:细胞周期检测结果提示三种dlbcl细胞g0/g1期的比例分别为30.23%、27.99%和30.45%,s期的比例分别为39.86%、70.23%和54.46%,g2/m期的比例分别为27.80%、2.51%和11.64%。三种细胞株s期和g2/m期的比例具有显著差异(p<0.001)。2.西达本胺诱导oci-ly3、oci-ly7和oci-ly8细胞发生不同程度凋亡:随着西达本胺浓度的升高,其诱导凋亡的作用越来越明显,但对于不同增殖特性的细胞,西达本胺诱导凋亡的能力不同(p=0.0020)。其中,西达本胺对oci-ly7细胞的促凋亡作用最为明显,细胞凋亡率由21.07%上升至96.54%;对oci-ly8细胞的促凋亡作用次之,细胞凋亡率由4.56%上升至40.98%;对oci-ly3细胞的促凋亡作用最弱,细胞凋亡率由5.84%上升至12.83%。3.西达本胺诱导oci-ly3、oci-ly7和oci-ly8细胞发生不同程度的g0/g1期阻滞:随着西达本胺浓度的升高,三种细胞株g0/g1期的比例增加(p=0.0388),同时伴有s期比例的降低(p=0.0015),而对g2/m期无明显影响(p>0.05)。其中,西达本胺对oci-ly3细胞的阻滞作用最强,随着浓度的升高其阻滞作用明显增强,g0/g1期的比例由30.23%上升至74.40%,s期的比例由39.86%下降至14.64%;对oci-ly8细胞的阻滞作用次之,g0/g1期的比例由30.45%上升至68.81%,s期的比例由54.46%下降至11.30%;对oci-ly7细胞的阻滞作用最弱,g0/g1期的比例由27.99%上升至38.47%,s期的比例由70.23%下降至54.85%。4.西达本胺诱导oci-ly3、oci-ly7和oci-ly8细胞发生不同程度的分化:西达本胺诱导oci-ly7细胞cd20、cd38表达升高,不影响cd138的表达,其中,随着作用时间的推移,cd20的表达明显升高;西达本胺对于oci-ly3细胞,轻度升高cd20的表达,不影响cd38和cd138的表达,但随着作用时间的推移,cd20的表达降低;西达本胺对oci-ly8细胞的cd20、cd38和cd138的表达均无明显影响。5.西达本胺对oci-ly3、oci-ly7和oci-ly8细胞的乙酰化h3蛋白表达水平影响不同:西达本胺不影响细胞h3蛋白的表达,但是不同程度地影响乙酰化h3蛋白的表达。对于oci-ly7细胞株,随着作用时间的推移,其乙酰化h3蛋白的表达水平持续升高;对于oci-ly8细胞株,随着作用时间的推移,其乙酰化h3蛋白的表达水平较前稍有下降;对于oci-ly3细胞株,随着作用时间的推移,其乙酰化h3蛋白的表达发生升高后显著下降的现象。6.西达本胺联合用药不同程度地提高了单药使用的疗效:较西达本胺单独用药组相比,西达本胺与利妥昔单抗的联合用药明显增加了oci-ly7细胞的凋亡率(p<0.05),但对于oci-ly3和oci-ly8细胞,联合用药并没有引起细胞凋亡率的增加(p>0.05);西达本胺与阿霉素以及地西他滨的联合用药,明显增加了三种dlbcl细胞株的细胞凋亡率(p<0.05)。结论1.西达本胺能够诱导dlbcl细胞体外发生凋亡、g0/g1期阻滞和分化,不同增殖特性的细胞表现不同。2.西达本胺对不同增殖特性细胞的作用与其导致的不同组蛋白乙酰化水平有关。3.西达本胺联合用药能够提高西达本胺单药治疗的疗效,其中联合阿霉素和地西他滨对不同增殖特性的细胞均有疗效。