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背景一氧化碳释放分子-3(Carbon monoxide-releasing molecule-3,CORM-3)是一种新型的水溶性的一氧化碳释放分子。近几年CORM-3在抑炎、抗凋亡、抗增殖等方面的作用已被证实。巨噬细胞作为炎症反应的常驻细胞或单核细胞衍生细胞,其吞噬能力是获得性免疫发展的关键因素。巨噬细胞在受到外界刺激后可以极化为功能状态的两个极端,即M1型巨噬细胞(促炎型巨噬细胞)与M2型巨噬细胞(抗炎型巨噬细胞)。牙周病是一种由于细菌侵犯牙周组织的而发生的一种慢性感染性疾病,其特征为牙周支持组织的破坏,牙周袋的形成,附着丧失及牙槽骨吸收。目的本实验以RAW264.7细胞为体外研究对象,以实验性牙周炎小鼠模型为体内研究对象,探究CORM-3是否可以调节RAW264.7细胞极化和这种调节作用的可能机制,以及CORM-3是否可以抑制牙周炎的进展,这将会为牙周病的治疗提供新的方法与理论基础。方法体外实验:RAW264.7细胞使用不同浓度CORM-3(0、100 μM、200 μM、400μM、800 μM)处理细胞24小时,使用CCK-8方法检测不同浓度药物对细胞活力的影响,筛选适合的药物浓度;将RAW264.7细胞分为五组:对照组,脂多糖(LPS)组,不同浓度CORM-3组(100 μM,200 μM,400 μM),使用流式细胞术检测各组中M0细胞(未分化),M1型巨噬细胞(促炎型)和M2型巨噬细胞(抑炎型)所占比例;提取总RNA进行实时定量聚合酶链反应(PCR),检测M1型巨噬细胞相关因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、一氧化氮合酶(iNOS)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6,及M2型巨噬细胞相关因子IL-10、精氨酸-1(Arg-1)mRNA的表达;提取细胞培养上清使用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测细胞培养上清中M1型巨噬细胞相关因子IL-1β、IL-6及M2型巨噬细胞相关因子IL-10的浓度。机制:提取各组总蛋白检测核转录因子-κB(NF-κB)信号通路相关蛋白p65与磷酸化 p65(p-p65),p50/p105 与 p-p50/p-p105,IκB 与 p-IκB 的表达水平。体内实验:取45只8周龄左右的雄性C57小鼠均分为三组:正常组,牙周炎组(LPS组),加药组(CORM-3组),正常组小鼠隔日腹腔注射生理盐水做对照,LPS组小鼠结扎上颌双侧第二磨牙,并在相应颊舌侧龈沟内各注射LPS溶液(1μg/μl)5 μl,共20 μl,隔日腹腔注射生理盐水,CORM-3组小鼠口腔内处置与LPS组相同,区别在于隔日腹腔注射CORM-3溶液(10 mg/kg),正常组不做任何处置隔日腹腔注射生理盐水做对照。在建模后第3、7、10日处死小鼠,摘取小鼠一侧上颌骨使用固定液固定24小时后脱钙、包埋、制作石蜡切片,免疫荧光检测局部炎症牙周组织中M1型及M2型巨噬细胞的数目;苏木精-伊红染色法(HE)观察CORM-3对小鼠牙周组织炎症程度的影响;小鼠另一侧上颌骨组织迅速放入液氮中保存以备提取组织总RNA进行PCR检测基因IL-1β、IL-6、IL-10、Arg-1的表达,眼球摘取法取静脉血ELISA检测小鼠血清中IL-6、IL-1β、IL-10的浓度。结果1.体外实验:①使用 100μM、200 μM、400 μM CORM-3 刺激 RAW264.7 细胞后,细胞活性随着药物浓度的增加而不断升高,并在药物浓度为400 μM时达到峰值,在药物浓度为800 μM时抑制细胞活性。②随着CORM-3浓度的升高,M1型巨噬细胞比例逐渐降低,M2型巨噬细胞比例逐渐升高,M0细胞的比例较致炎组升高。③随着CORM-3浓度的升高,M1型巨噬细胞相关促炎因子TNF-α、iNOS、IL-1β、IL-6的mRNA表达呈现出浓度依赖性逐渐降低,M2型巨噬细胞相关抑炎因子IL-10、Arg-I浓度较致炎组显著升高。④细胞培养上清中,M1型巨噬细胞相关促炎因子IL-1β、IL-6浓度随药物浓度的升高逐渐下降,M2型巨噬细胞相关抑炎因子IL-10浓度上升且在药物浓度为200 μM时达到最大。2.机制:Western Blot 结果表明,随着 CORM-3 浓度升高,p-p65、p-p50/p-p105、p-IκB的表达显著降低。3.体内实验:①免疫荧光结果表明,在接受CORM-3注射的实验性牙周炎小鼠的局部牙周组织中,M1型巨噬细胞的数目显著低于未经CORM-3注射组,而M2型巨噬细胞的数目显著多于未经CORM-3注射组。②HE染色结果显示,接受CORM-3注射的实验性牙周炎小鼠的局部牙周组织中,免疫活性细胞浸润的程度显著低于未经CORM-3注射组;余留牙槽骨的外形相对规则,牙槽骨的吸收程度显著低于未经CORM-3注射组;牙周袋的深度较未经CORM-3注射组相比较浅。③PCR结果显示:与LPS组相比,接受CORM-3注射的实验性牙周炎小鼠局部牙周组织中M1型巨噬细胞相关致炎因子IL-1β、IL-6 mRNA表达显著降低,而M2型巨噬细胞相关抑炎因子Arg-1、IL-10 mRNA表达显著升高。④ELISA结果显示,与LPS组相比,接受CORM-3注射的实验性牙周炎小鼠血清中M1型巨噬细胞相关促炎因子IL-1β、IL-6浓度显著降低,M2型巨噬细胞相关抑炎因子IL-10的浓度显著升高。结论体外实验表明,CORM-3可以抑制LPS作用下的RAW264.7细胞向M1型分化,促进其向M2型分化。CORM-3通过调节巨噬细胞的分化,抑制M1型巨噬细胞相关的促炎因子的基因表达与分泌,促进M2型巨噬细胞相关的抑炎因子的基因表达与分泌。CORM-3对巨噬细胞极化的调节作用及抑炎作用可能与其抑制NF-κB信号通路活化相关。体内实验表明,CORM-3能够抑制实验性牙周炎小鼠局部牙周组织中巨噬细胞向M1型分化,促进其向M2型分化。CORM-3能够抑制实验性牙周炎小鼠局部牙周组织的炎性反应,减少牙槽骨的吸收。同时,CORM-3能够抑制牙周炎小鼠局部牙周组织及血清中M1型巨噬细胞相关的促炎因子的基因表达与分泌,促进M2型巨噬细胞相关的抑炎因子的基因表达与分泌。本研究表明,CORM-3能够抑制炎性刺激下巨噬细胞向M1型极化,促进向M2型极化,显示了对炎性反应的抑制作用。本实验为CORM-3用于牙周炎的治疗提供了实验基础和理论依据。