研究背景和目的：成熟性畸胎瘤由来源于两胚层或三胚层的成熟组织构成,通常含有皮肤、皮脂腺、汗腺、毛发,部分有牙齿及神经组织。成熟性畸胎瘤中所含皮肤样组织结构,本文称之为畸胎瘤瘤皮。能否将这些皮肤样组织(或瘤皮)用于损伤皮肤的修复,如果能用于损伤修复,所长出的皮肤组织是否具有正常的皮肤组织结构,所修复的组织是原损伤皮肤组织增生所形成的皮肤组织还是由畸胎瘤组织中的皮肤组织增生所形成的皮肤组织,由畸胎瘤组织中的皮肤组织增生所形成的皮肤组织是否会形成皮肤肿瘤或形成新的畸胎瘤,这是我们在观察畸胎瘤病理组织结构中提出的新问题,尚未见文献报道,是本研究拟解决的核心问题。假设畸胎瘤瘤皮能用于损伤皮肤的修复,那么为解决临床移植皮片供应不足,满足临床对皮肤移植皮片的需求,将畸胎瘤瘤皮长期保存起来以备不时之需也是本研究拟探讨的重要问题。深低温冷冻保存是目前公认的长期保存移植皮片最有效的方法。但在深低温冷冻保存畸胎瘤瘤皮组织之前并无经验,而且尚未见有关冷冻保存畸胎瘤瘤皮组织的报道。方法：1.成熟性囊性畸胎瘤诊断及瘤皮组织鉴定成熟性囊性畸胎瘤瘤皮取自南方医科大学附属南方医院妇产科卵巢成熟性囊性畸胎瘤患者。卵巢畸胎瘤肿物切除后,用无菌的手术器械切开肿物,进行大体观察,并取下似成熟性囊性畸胎瘤之带毛发的皮肤样组织,放入10%中性甲醛固定,进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及苏木素-伊红染色。2.成熟性囊性畸胎瘤瘤皮、BABL/c-nu/nu小鼠鼠皮组织结构及免疫组化表型结果健康、SPF级的免疫缺陷小鼠BALB/c-nu/nu小鼠,4-8周龄,质量16-22g,购自南方医科大学实验动物中心,所有实验用小鼠均在南方医科大学实验动物中心屏障动物房中饲养,温度控制在28℃。分别取成熟性囊性畸胎瘤瘤皮及BABL/c-nu/nu小鼠鼠皮,固定于10%中性甲醛溶液中,常规石蜡包埋切片并HE染色后进行组织形态观察,并行panCK (AE1/AE3)、CK5/6、CK7、CK8、CK14、 CD31、CD34及Ⅷ免疫组织化学染色。3。成熟性囊性畸胎瘤瘤皮BABL/c-nu/nu小鼠移植及鉴定健康、SPF级的BALB/c-nu/nu小鼠(n=21只),周龄、质量及饲养等均同上。移植术前,用无菌手术器械将所收集的瘤皮组织切成约1cm2的组织块,刮去皮肤表面的油脂,剪去皮肤表面的毛发及皮下脂肪组织,制成包含表皮和真皮的全厚皮片,放入RPMI1640培养基中备用。该部分实验分为实验组(n=16)和对照组(n=5)。实验组：取BABL/c-nu/nu小鼠称重,腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液(40mg/kg)麻醉。BABL/c-nu/nu小鼠取侧卧位,皮肤消毒后,在BABL/c-nu/nu小鼠侧背部剪去约1cm2的皮肤及皮下脂肪,保留完整的筋膜,制备成皮肤移植床。将制备好的畸胎瘤瘤皮组织吻合BABL/c-nu/nu小鼠皮肤的移植床上,带毛发的一面朝上,另一面朝下,用7-0尼龙手术缝线间断缝合,创缘用镊子对齐。凡士林纱布覆盖其上,缠上创可贴,单笼饲养并标记。移植术后对BABL/c-nu/nu小鼠进行一般状况和外观形态观察,连续观察60天,并分别于实验第1、2、3、4周取移植瘤皮组织用10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋切片并HE染色后进行显微形态观察。移植术后60天,实验终止,取愈合的瘤皮移植物,10%中性甲醛固定,常规石蜡包埋切片并HE染色后进行显微形态观察。CK5/6免疫组织化学染色,透射电镜观察,鉴定愈合皮肤组织的组织来源。对照组：去除BABL/c-nu/nu小鼠皮肤及皮下脂肪组织,制成约1cm2的皮肤缺损区后,直接覆盖凡士林纱布,粘上创可贴。手术后30天,实验终止。取下创面愈合区组织,固定于10%的中性甲醛中,常规组织学观察及CK5/6免疫组织化学染色鉴定愈合区域的皮肤组织来源。4.成熟性囊性畸胎瘤瘤皮组织的深低温冷冻保存冻存：将无菌的畸胎瘤瘤皮组织制成1cm2大小的组织块,刮去皮肤表面的油脂,剪去皮肤表面的毛发及皮下脂肪组织,将瘤皮组织放入冻存管中,再向冻存管中加入1ml的冻存缓冲液,置于4℃冰箱中渗透30min；去除冻存管中的冻存缓冲液,加入lml的冻存液,置于4℃冰箱中渗透30m1n；-20℃冰箱30min;-80℃过夜(至少12h)；再置-198℃液氮中。复苏：将盛有瘤皮组织和冻存液的冻存管从液氮中取出,迅速放入37℃水浴中并轻轻摇晃直到冰融化；用移液器吸出冻存液,加入0.5 mol/L海藻糖复苏缓冲液中,室温下作用15min；用RPMI1640培养基冲洗三次去除复苏缓冲液,将瘤皮组织放入6孔培养板中,每孔加入5m1的RPMI1640培养基；将盛有瘤皮组织的6孔培养板置于5%C0237℃的培养箱中3h。取新鲜瘤皮(n=9)和复苏后瘤皮(n=9)组织部分样本固定于10%中性甲醛,之后行石蜡包埋切片及HE染色,常规组织学观察；用Ki-67免疫组织化学染色观察并定量分析新鲜瘤皮和复苏后瘤皮组织的增殖能力；部分样本进行组织MTT试验,检测新鲜和复苏后瘤皮组织的生物活性；部分样本用2.5%戊二醛固定后行透射电镜检测观察新鲜和复苏后瘤皮组织超微结构的变化。5.低温冷冻复苏后畸胎瘤瘤皮组织BABL/c-nu/nu小鼠移植健康、SPF级的BALB/c-nu/nu小鼠(n=12),周龄、质量及饲养等均同上取BABL/c-nu/nu小鼠称重后腹腔注射1%戊巴比妥钠溶液(40mg/kg)麻醉。BABL/c-nu/nu小鼠取侧卧位,皮肤消毒后,在BABL/c-nu/nu小鼠侧背部剪去约1cm2的皮肤及皮下脂肪,保留完整的筋膜,制备成皮肤移植床。将冷冻复苏后的畸胎瘤瘤皮组织镶嵌在BABL/c-nu/nu小鼠皮肤的移植床上,带毛发的一面朝上,用7-0尼龙手术缝线间断缝合,创缘用镊子对齐。凡士林纱布覆盖其上,缠上创可贴,单笼饲养并标记。移植术后对BABL/c-nu/nu小鼠进行一般状况和外观形态观察。移植术后60天,实验终止,取愈合的的瘤皮移植物并用10%中性甲醛固定,石蜡切片,HE染色后观察形态学改变；CK5/6免疫组织化学染色鉴定愈合皮肤组织的组织来源。6.成熟性囊性畸胎瘤瘤皮BABL/c-nu/nu小鼠移植实验对BABL/c-nu/nu小鼠脏器的影响BABL/c-nu/nu小鼠瘤皮移植术后60天,实验终止,用1%戊巴比妥钠(80mg/kg)麻醉处死后,取其脏器放入10%中性甲醛中固定,常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片及苏木素-伊红染色观察其病理学形态改变。结果：1。成熟性囊性畸胎瘤诊断及瘤皮组织鉴定畸胎瘤患者手术切除肿物大体上呈囊性,囊内容物为皮脂样物,混有毛发,并见有毛发附着的皮肤样组织,部分瘤组织中可见骨组织和牙齿。显微镜下观察见皮肤样组织,表层被覆角化复层鳞状上皮,上皮下可见皮脂腺、汗腺、毛发、胶原纤维及神经、血管；瘤组织内未见恶性的非成熟组织存在。因此诊断为成熟性囊性畸胎瘤。畸胎瘤肿物中带有毛发的皮肤样组织为本研究所需的畸胎瘤瘤皮组织。2.成熟性囊性畸胎瘤瘤皮、BABL/c-nu/nu小鼠鼠皮组织结构及免疫组化表型结果瘤皮与鼠皮显微形态结构的差别：畸胎瘤瘤皮表皮为角化复层鳞状上皮,上皮层较厚,约5-6层；瘤皮组织上皮下皮脂腺腺体及毛囊体积大,毛囊数目较少;BABL/c-nu/nu小鼠皮肤表皮层较薄,约2-3层,BABL/c-nu/nu小鼠皮肤皮脂腺腺体体积小,毛囊数目多且体积小。瘤皮与鼠皮免疫组化检查结果表明：panCK (AE1/AE3)在瘤皮和鼠皮的上皮均有表达；CK5/6在瘤皮表皮和皮脂腺表达阳性,而鼠皮中表达阴性；CK7、CK8在瘤皮和鼠皮中表达阴性；CK14在瘤皮的表皮和皮脂腺表达阳性,在鼠皮的表皮及毛囊表达阳性；CD31在瘤皮皮下的毛细血管表达阳性,鼠皮的血管微弱阳性；CD34在瘤皮的间质和血管表达强阳性,在鼠皮的间质见微弱表达；Ⅷ在瘤皮皮下毛细血管表达阳性,鼠皮的毛囊见微弱表达。因此瘤皮及鼠皮上述免疫组化检查结果区别主要表现在CK5/6上,瘤皮之表皮及毛囊阳性,而鼠皮阴性。3.成熟性囊性畸胎瘤瘤皮BABL/c-nu/nu小鼠移植及鉴定畸胎瘤瘤皮移植至BABL/c-nu/nu小鼠损伤区。移植后1周,移植物外观呈乳黄或乳白色,质地柔软；显微镜下可见上皮细胞和皮脂腺变性,血管扩张充血。第2周,移植物外观周边呈黄色,质地偏硬,中央部分呈乳白色,质地较软；镜下瘤皮及损伤区域鼠皮增生并连接为一体,真皮层可见皮脂腺、汗腺及幼稚毛囊。移植物表面可见一层痂皮,镜下为变性坏死的上皮组织及角化物。第3周,痂皮脱落,可见移植物与小鼠皮肤组织紧密连接,外观呈棕褐色或乳白色,表面可见点状凹陷,该凹陷为毛囊开口；镜下见鳞状上皮角化,上皮下可见皮脂腺、汗腺、毛发及成熟脂肪组织。第4周,愈合皮肤呈褐色,表面可见毛发长出,镜下见皮脂腺、汗腺及毛发。第25-35天肉眼可见毛发长出体表。种植术后60天,大部分(10/12)愈合的皮肤组织呈棕褐色,修复区域未见缩小,表面可见浓密的毛发长出,未见明确瘢痕组织形成,镜下见角化鳞状上皮,皮脂腺、汗腺及毛发。对照组BABL/c-nu/nu小鼠术后1月,缺损区瘢痕形成,并出现瘢痕收缩,显微镜下见被覆上皮,真皮层见胶原组织增生,未见皮脂腺及毛囊。将畸胎瘤瘤皮种植区及其周边组织取下并固定于10%中性甲醛溶液中,行HE染色和人细胞角蛋白CK5/6免疫组织化学染色,结果表明：畸胎瘤瘤皮种植到BABL/c-nu/nu小鼠体表可见种植生长区组织毛囊稀疏,皮脂腺丰富,可见汗腺,可见毛发长出,表皮及毛囊上皮CK5/6阳性,表明其为人源性畸胎瘤瘤皮组织。种植物边缘区毛囊密集,皮脂腺小,未见明确汗腺,表皮及毛囊上皮CK5/6阴性,表明其为鼠皮组织。对照组愈合皮肤表皮薄,CK5/6免疫组化染显示其上皮阴性。将移植术后带有毛发的愈合移植物行透射电镜观察,可见愈合移植物表皮与基底膜之间半桥粒结构清晰,而鼠皮的基底膜半桥粒结构松散。移植物基底层细胞可见黑色素颗粒,但是BABL/c-nu/nu小鼠皮肤较移植物皮肤薄,观察全层结构均未发现有黑色素颗粒存在。表明愈合移植物并非为BABL/c-nu/nu小鼠的皮肤,而是畸胎瘤瘤皮组织。4成熟性囊性畸胎瘤瘤皮组织的深低温冷冻保存冻存复苏后瘤皮形态结构改变：瘤皮组织在深低温冻存复苏后表皮和真皮结构保存完好,表皮及真皮内未见空泡变性及冰晶形成,表皮与真皮组织之间未见分离现象。与正常瘤皮组织结构相似。透射电镜检测结果显示：冻存后瘤皮组织的表皮与基底膜之间的半桥粒结构保存完好,细胞间的桥粒连接机构未见破坏,细胞胞浆内线粒体、核糖体、张力丝等细胞器结构未见明显改变。冻存复苏后瘤皮的增殖能力：Ki-67为细胞核阳性,细胞核为棕黄色的细胞为Ki-67阳性细胞。显微镜下观察冷冻复苏后瘤皮Ki-67的表达强度与新鲜瘤皮相似。而且,对新鲜和冷冻复苏后瘤皮Ki-67蛋白PU值测定,新鲜瘤皮组织Ki-67蛋白PU值为26.098±1.202,冷冻复苏后的瘤皮组织Ki-67蛋白PU值为27.008±1.480,统计结果显示两者之间表达差异无显著(P=0.816)。冻存复苏后瘤皮的生物活性：MTT试验检测新鲜瘤皮组织的活性指数为0.090±0.017(0.068-0.117),而冷冻复苏后瘤皮组织的活性指数为0.076±0.012(0.062-0.097),冻存后瘤皮组织的活性指数百分数为86.17±9.23%。5.低温冷冻复苏后畸胎瘤瘤皮组织BABL/c-nu/nu小鼠移植低温冷冻复苏的瘤皮组织移植术后愈合良好。移植术后2-4周,移植瘤皮表面形成一层棕色痂皮,脱落后,暴露的痂皮下组织呈乳白色,与周围BABL/c-nu/nu小鼠皮肤连接紧密,表面散在点状毛孔开口。移植术后60天,愈合移植物大部分(11/12)呈乳白色,表面可见黑褐色毛孔出口,未见有黑色毛发长出。愈合的移植物显微镜下见为表面被覆角化鳞状上皮,可见毛囊的开口,真皮层见少量的汗腺,未见皮脂腺及毛发。细胞角蛋白CK5/6免疫组织化学染色表明瘤皮组织的表层皮肤未见阳性表达,真皮层可见阳性表达的上皮巢及汗腺组织。将低温冷冻前后瘤皮组织行CK5/6免疫组织化学染色,冷冻前后瘤皮组织的表皮、皮脂腺和汗腺均表达CK5/6,低温冷冻对CK5/6抗原表达无影响。因此,我们认为低温冷冻复苏后瘤皮移植至BABL/c-nu/nu小鼠身上后,愈合的移植物一部分为畸胎瘤瘤皮,一部分为BABL/c-nu/nu小鼠皮肤组织。从CK5/6表达的部位显示真皮层的上皮巢和汗腺组织为畸胎瘤瘤皮,而位于表层的表皮为BABL/c-nu/nu小鼠的皮肤。6.成熟性囊性畸胎瘤瘤皮BABL/c-nu/nu小鼠移植实验对BABL/c-nu/nu小鼠脏器的影响畸胎瘤瘤皮移植术后60天,大体及显微镜下观察BABL/c-nu/nu小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、肾上腺、胰腺、胃、小肠、卵巢及子宫器官未见明显病变。心脏：镜下见心肌纤维呈短柱状,有分支,血管扩张充血；肝脏：肝小叶结构完整,中央静脉和肝血窦未见扩张充血,肝细胞未见坏死；脾脏：红髓、白髓结构完整,红髓脾窦淤血；肺脏：支气管及肺泡结构完整,间质血管扩张充血；脑、肾脏、肾上腺、胰腺、卵巢、子宫、胃及小肠组织结构完整,未见明显病变。结论：本研究首次探讨了成熟性囊性畸胎瘤瘤皮异种移植问题,取得以下创新：1、成熟性畸胎瘤中的肿瘤性皮肤样结构成份可再生利用,能作为幼稚皮肤组织用于损伤皮肤的修复,且修复效果非常满意,表现在：瘤皮移植后生长状态良好,并可见黑色毛发长出。显微镜下可见表皮愈合良好,真皮层可见皮脂腺及汗腺存在,可见毛发结构。移植术后愈合的瘤皮移植物出现色素。2、畸胎瘤瘤皮组织可行深低温冷冻保存、复苏和移植。深低温冷冻之瘤皮组织形态和超微结构保存完好,其复苏后仍具有与新鲜瘤皮组织相同的增殖能力,活性指数百分数达86.17%。深低温冷冻复苏后的瘤皮组织移植至BABL/c-nu/nu小鼠损伤体表后,愈合良好,外观呈白色,修复愈合的皮肤组织部分为瘤皮组织,部分为BABL/c-nu/nu小鼠皮肤组织,供体瘤皮和受体鼠皮共同参与了BABL/c-nu/nu小鼠皮肤创伤的修复。3、成熟性囊性畸胎瘤瘤皮移植术后,对BABL/c-nu/nu小鼠的脏器无实质性损害,未见肿瘤形成。4、移植性新生瘤皮中长出毛发,使我们想到这一技术今后还可用于秃顶的治疗。冻存后的瘤皮移植不仅能对损伤的皮肤进行修复,修复后的瘤皮呈乳白色,可解决皮肤移植术后出现色素沉着影响美观的难题。冻存复苏后瘤皮无毛发生长,但是汗腺结构存在,因此可满足不需要毛发生长部位(如手掌面)的移植需要,并保存了皮肤排汗的潜在功能。5、CK5/6可用于畸胎瘤瘤皮与BABL/c-nu/nu小鼠鼠皮的鉴别。畸胎瘤瘤皮上皮组织CK5/6阳性,BABL/c-nu/nu小鼠鼠皮CK5/6阴性；此外,CD34在畸胎瘤瘤皮和BABL/c-nu/nu小鼠鼠皮的鉴别也有一定的价值,畸胎瘤瘤皮间质CD34明显阳性,BABL/c-nu/nu小鼠皮肤CD34弱阳性。