在膜蛋白结构与功能研究领域,由于魔角旋转固体核磁共振(Magic Angel Spinning Solid-State Nuclear Magentic Resonance, MAS ssNMR)可以在磷脂双分子层近天然环境下对目的蛋白进行研究,是研究膜蛋白结构、功能与动力学等的重要工具,从而被认为是独具优势且最有发展前景的技术。膜蛋白是细胞内外物质交换与能量转移的桥梁,行使转运器、通道、酶等重要功能。部分膜蛋白还与人类疾病相关,可作为重要的药物靶点。因此,研究膜蛋白的结构和功能具有非常重要的意义。然而,由于膜蛋白极度疏水的特性,以及膜蛋白之间的结构与性质共性很低,膜蛋白的样品制备具有相当大的难度,且没有简单的规律可以遵循。超量表达、稳定纯化、脂膜重建等样品制备过程需要进行大量的条件筛选。另外,用魔角旋转固体核磁共振研究膜蛋白的结构、功能以及动力学对环境的依赖性尚不充分,需要建立膜蛋白模型对其进行系统详尽的研究。在本文中,我们摸索出了一套适用于魔角旋转固体核磁研究的膜蛋白样品制备流程。并在此基础上,制备得到了高均一性的模型蛋白大肠杆菌二酯酰甘油激酶(Diacylglycerol kinase, DAGK)的脂质体,在磷脂双分子层环境中研究了目的蛋白与水相关的动力学性质以及二级结构与拓扑结构。(1)膜蛋白的超量表达与纯化。我们以EV712B、HCV p7(lb)、HCV p7(5a)与HIV-1Vpu四个病毒孔道膜蛋白为主要研究对象,发展了一套His6-Tag融合表达膜蛋白的优化流程,使得几个膜蛋白的表达量都达到10mg/L M9以上,甚至可达30-40mg/L M9。研究过程中,我们发现了His6-Tag的位置对目的蛋白表达量的影响,为膜蛋白表达载体的设计提供了参考；我们提出了膜蛋白表达中关键的影响因素及条件优化方向,设计了一套简洁且行之有效的表达优化流程；我们通过优化亲和层析纯化过程中的主要因素,可一步亲和层析纯化得到高纯度(>95%纯)的膜蛋白样品。(2)膜蛋白融合标签MBP-Tag的酶切移除策略。我们以融合表达的膜蛋白MBP-MrpF为底物,研究了TEV酶切融合标签的限制因素。首先,我们发现了烟草蚀刻病毒(Tobacco Etch Virus,TEV)蛋白酶酶切位点影响了目的蛋白结构,继而抑制目的蛋白的表达量,提出了保持目的蛋白N-末端的天然结构的解决方案；其次,我们筛选了三种对TEV酶活无抑制作用的膜蛋白纯化与结构研究中常用的去垢剂；最后,我们证实了空间位阻对酶切效率的影响,并通过延长融合标签与目的蛋白之间的linker消除了空间位阻效应。(3)]DAGK与水相关动力学的研究。我们制备了DAGK在DMPC/DMPG磷脂双分子层中的高分辨率的脂质体样品,在不同的水合条件下,研究了不同区域的氨基酸残基的运动性质。我们采集15N INEPT实验鉴别出两种运动性强弱不同的氨基酸残基,分别为D-残基与J-残基；通过C’ CSA与’H-15N偶极耦合2D实验研究D-残基在亚微秒时间尺度内运动强度与运动速率对水含量的依赖性；此外,我们发现水对膜蛋白D-残基的影响是通过磷脂分子层来传递的,因此我们还研究了水含量对磷脂双分子层相态变化的影响。(4)]DAGK二级结构与拓扑结构研究。我们用3D MAS ssNMR实验解析了DAGK在近天然环境大肠杆菌磷脂膜(E.coli total lipids)中的二级结构与拓扑结构。与液体核磁共振或X-Ray晶体衍射解析的结构进行比较,发现三者并不完全相同。膜蛋白所处环境的不同可能导致结构的差异,甚至会影响膜蛋白的功能活性。我们考察了DAGK在近天然环境大肠杆菌磷脂膜(E.coli total lipids)中的活性,结果与文献报道相符合。我们的工作为环境对膜蛋白的结构功能影响提供了新的证据,同时也说明了MAS ssNMR是多次跨膜的膜蛋白结构研究的有力工具,可解析最接近天然环境下的膜蛋白结构,并研究其天然的功能活性。