研究背景骨肉瘤（osteosarcoma）是骨肿瘤中一种常见的原发恶性肿瘤，好发于青少年，其恶性程度高，男多于女。骨肉瘤患者确诊时，80%~90%已经出现远处微小转移灶，这些微小转移灶多数发生在肺部，单纯的手术治疗5年生存率低于20%[1]。Rosen在1976年提出的新辅助化疗（Neoadjuvant chemotherapy）的概念，即术前给予化疗，结合临床、影像学及病理学评估，确定化疗的敏感性及肿瘤坏死的程度，制定术后的化疗方案，通过有效地术前化疗控制远处在转移灶的发展，提高保肢手术几率。新辅助化疗的广泛应用，以及外科技术和材料学的发展，大大降低了骨肉瘤患者的致残率、致死率，使骨肉瘤5年生存率提高至60%~80%，部分患者还可长期带瘤生存，提高了患者的生活质量[2]。WWOX（WW domain-containing oxidoreductase）基因是Bednarek等在2000年应用鸟枪基因测序技术分离并分析鉴定出的一个新基因，位于人类普通的染色体脆性位点16q23.3-q24，跨越整个常见染色体脆性位点FRA16D，含有9个外显子，共编码414个氨基酸[3]。研究发现，多种肿瘤细胞中出现WWOX基因表达失活或缺失，提示WWOX基因属于抑癌基因，能抑制肿瘤细胞的增殖，在基因组和转录水平影响影响WWOX基因的异常可能与肿瘤的发生、发展有关。已有研究表明多种肿瘤如骨肉瘤、结肠癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等中存在WWOX的表达降低，频发的杂合性丢失、mRNA转录异常及WWOX蛋白表达异常等证明WWOX为抑癌基因[3，4]。DNA甲基化是遗传外修饰的重要调控方式，与基因突变、缺失等遗传学改变相比，DNA甲基化并未改变DNA的基因序列，但基因的表达受到调控，DNA甲基化修饰通常发生在富含CG序列的二核苷酸上，通过修饰个别碱基来调控基因的转录，是可逆的。甲基化抑制剂5’-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷酸（5’-aza-2’-deoxycytidine，5-Aza-CdR），与DNA甲基化酶共价结合，降低甲基化酶活性，有效逆转DNA的甲基化状态[5.6]。临床上目前主要用于血液系统恶性肿瘤的治疗，取得了一定的疗效[68],单由于其细胞毒性作用较强，限制其在临床上的应用。肼苯哒嗪是临床上用于治疗心血管疾病，大量研究表明，肼苯哒嗪能作为去甲基化药物能有效地使T淋巴细胞回复相关抗原功能、诱导P16基因mRNA和蛋白的表达。针对结肠腺瘤性息肉病基因（adenomatous polyposis coli,APC）、六氧甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶基因（O6-methylguanine-DNAmethyltransferase, MGMT）、FHIT基因（fragile histidine triad,FHIT）、DAK基因和P16基因应用肼苯哒嗪进行的治疗结果也证实了肼苯哒嗪作为去甲基化药物能够有效的逆转抑癌基因的甲基化状态[7]，在肿瘤治疗中有良好的前景。目的通过观察肼苯哒嗪、5’-氮杂-2’-脱氧胞嘧啶核苷酸（5’ aza2’ deoxycytidine，5Aza CdR）及其联合使用对人成骨肉瘤细胞MG63的生长抑制作用，并检测对骨肉瘤细胞中WWOX基因表达的调控作用，初步明确肼苯哒嗪对骨肉瘤细胞的作用机制方法取对数生长期的人骨肉瘤细胞株MG63制成细胞悬液，计数板计数5×104个/ml，加入96孔板。分为肼苯哒嗪组(药物浓度为0.1、l.0、10μmol／L)、5AzaCdR组(药物剂量为5、10、20μmol／L)、肼苯哒嗪联合5Aza CdR组(药物剂量为0.1μmo/L+5μmo/L、l.0μlmol／L+10μlmol／L、10μmol／L+20μmol／L)及对照组(培养基)。噻唑蓝（MTT）比色法检测药物对MG63细胞生长抑制作用；流式细胞仪检测药物对细胞周期分布作用及凋亡影响；Real Time PCR技术检测WWOX mRNA表达改变情况；Western blot检测药物处理后各组细胞中WWOX蛋白表达水平。结果肼苯哒嗪、5-Aza-CdR单独应用均可抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖，且呈浓度依赖性，并且与作用时间相关，联合应用时对MG-63细胞增殖的抑制作用更明显，各组间的差异具有统计学意义（P<0.05）；肼苯哒嗪、5-Aza-CdR单用可诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡，联用时诱导凋亡作用加强。肼苯哒嗪、5-Aza-CdR对骨肉瘤细胞的WWOX基因表达有促进作用，联合作用WWOX mRNA表达明显增强(4.3576±0.1278)，WWOX蛋白表达增加明显（0.4572±0.0038），与其他组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论肼苯哒嗪可明显抑制骨肉瘤MG-63细胞的增殖并诱导其凋亡，并促进WWOX基因的表达。其机制可能是肼苯哒嗪能够使抑癌基因WWOX基因甲基化状态逆转，表达增加，抑制MG-63细胞的增殖。