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实验背景:肠道病毒为微小RNA病毒,是引起手足口病的主要病原体,其中主要包括新型肠道病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒和脊髓灰质炎病毒等。儿童较易感染。临床症状轻者有乏力﹑低热、腹泻和四肢和嘴疱疹,少数严重患者会出现神经性和呼吸道的并发症,发生瘫痪性疾病、病毒性脑膜炎、心肌损伤等病症,甚至导致死亡。肠道病毒的致病机制尚未完全研究清楚,目前也无成熟有效的针对性抗病毒药物。在肠道病毒的复制过程中,一个关键因子—3C蛋白酶发挥着重要的作用,其主要功能是通过影响宿主前体m RNA的加工来抑制宿主基因表达并加工病毒蛋白使其成熟,是一个重要的药物靶点。受体相互作用蛋白激酶3（receptor interacting protein 3,RIPK3）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶家族（cysteinyl aspartate specific proteinase family,Caspase）是参与宿主细胞程序性死亡的关键分子。本研究着重探究由肠道病毒71型（Enterovirus 71,EV71）和柯萨奇病毒A组6型（Coxsackievirus A6,CA6）的3C蛋白酶对RIPK3和Caspase的具体调控机制,以期为抗病毒药物的发展提供一个新的思路。实验方法:第一部分采用人肾上皮细胞系293T作为宿主细胞。第一步,将p CMV-HA-RIPK3质粒（全长60KD左右）瞬时转染293T细胞,分别使用凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK（抑制Caspase-3活化）、Z-IETD-FMK（抑制Caspase-8活化）和Z-LEHD-FMK（抑制Caspase-9活化）处理293T细胞,观察RIPK3的表达情况,筛选调控RIPK3的Caspase蛋白。并使用蛋白酶体抑制剂（MG132--抑制E3蛋白酶体降解途径）和自噬抑制剂（3MA--抑制自噬体的形成和氯喹--抑制自噬体与溶酶体的融合过程）处理293T细胞,通过抑制常见的降解途径,排除可能的影响因素。第二步,构建VR1012-FLAG-RIPK3-MYC质粒,瞬时转染293T细胞,再分别使用凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK、Z-IETD-FMK和Z-LEHD-FMK处理,用FLAG和MYC标签抗体检测RIPK3表达情况,进一步明确筛选的Caspase蛋白。第三步,根据RIPK3的氨基酸序列和Caspase-3、-8、-9通常识别序列,查找RIPK3上Caspase可能的切割位点。构建突变质粒,同时免疫共沉淀实验检测RIPK3与Caspase的结合情况,最终确定调控RIPK3的Caspase蛋白。第二部分第一步,将VR1012-FLAG-RIPK3-MYC与VR1012-EV71 3C-HA共转染于293T细胞,通过FLAG（N端）和MYC（C端）标签抗体检测RIPK3表达情况,从而验证3C蛋白酶是否对RIPK3有切割作用。并观测是否随着3C蛋白酶的加入,影响Caspase-8对RIPK3的切割。第二步,分别采用VR1012-EV71 3C（His40）-HA、VR1012-EV71 3C（Glu71）-HA和VR1012-EV71 3C（Cys147）-HA的蛋白酶催化活性位点突变质粒进一步验证3C蛋白酶对RIPK3的切割,并且验证3C蛋白酶是否是通过其酶催化活性使Caspase-8切割RIPK3的条带逐渐减弱。第三步,验证柯萨奇病毒A6型的3C蛋白酶是否也具有切割RIPK3的能力,CA63C蛋白酶加入后,是否会出现与EV71 3C蛋白酶相似的结果。进一步证实肠道病毒3C蛋白酶对RIPK3和Caspase-8的干扰,将VR1012-CA6 3C-MYC与VR1012-FLAG-RIPK3-MYC共转染293T细胞,观察RIPK3各条带之间的变化。结果与分析:第一部分1.Z-DEVD-FMK（抑制Caspase-3活化）和Z-IETD-FMK（抑制Caspase-8活化）可抑制RIPK3在293T细胞中的下调,Z-LEHD-FMK（抑制Caspase-9活化）、蛋白酶体抑制剂（MG132）和自噬抑制剂（3MA和氯喹）对RIPK3的表达无影响,表明RIPK3的下调与Caspase-3和/或-8有关,与降解途径和Caspase-9无关。2.将VR1012-FLAG-RIPK3-MYC转染于293T细胞中可产生35KD（FLAG-N端）和25KD（MYC-C端）的切割条带。并且Z-DEVD-FMK（抑制Caspase-3活化）和Z-IETD-FMK（抑制Caspase-8活化）而非Z-LEHD-FMK（抑制Caspase-9活化）抑制了切割条带的产生,表明Caspase-3和/或-8通过切割作用下调了RIPK3。3.根据RIPK3的氨基酸序列和Caspase-3、-8和-9通常识别序列,分别为DXXD、XEXD和I/V/L---EXD。发现RIPK3上有一个位点（TEMD-即D328位点）可成为Caspase-3、-8、-9切割的候选位点。并且突变RIPK3的D328位点为A328后,35KD和25KD的切割条带消失。表明RIPK3转染293T细胞产生的切割条带与D328位点有关。并且可能只有Caspase-8参与了切割RIPK3的过程（Caspase-3识别序列为DXXD,Caspase-9识别序列为I/V/L---EXD,均与TEMD不同）。通过免疫共沉淀进一步证实,其结果为Caspase-8能结合RIPK3,而Caspase-3不能结合RIPK3。因此,综上所述,在293T细胞中切割RIPK3的调控蛋白为Caspase-8。第二部分1.VR1012-FLAG-RIPK3-MYC与VR1012-EV71 3C-HA共转染于293T细胞,可产生47KD和13KD左右的两条条带。因此EV71 3C蛋白酶可切割RIPK3。2.突变的EV71 3C蛋白在失去酶催化功能但仍存在结合功能的条件下,能抑制3C蛋白酶对RIPK3的切割,但不会抑制Caspase-8对RIPK3的切割作用。因此,3C蛋白酶的酶催化活性位点是切割RIPK3的重要部位,也是干扰Caspase-8切割RIPK3的重要部位,并且3C蛋白酶其结合活性的空间阻碍作用并不干扰Caspase-8对RIPK3的切割,所以,3C蛋白酶有可能在切割RIPK3后,干扰了Caspase-8对RIPK3的识别性。3.CA6 3C蛋白酶同样会切割RIPK3,产生47KD和13KD左右的条带,并且Caspase-8切割RIPK3所产生的25KD和35KD左右的条带也可能因为CA6 3C蛋白酶的作用而下调。结论:1.过表达RIPK3在293T细胞中可激活Caspase的活化,并且活化的Caspase-8而不是Caspase-3和9可通过识别RIPK3的D328位点（TEMD）切割RIPK3,并且RIPK3不受到E3蛋白酶体和自噬体及溶酶体的降解。2.EV71和CA6病毒的3C蛋白酶可切割RIPK3。3.EV71病毒的3C蛋白酶通过其酶催化活性而不是通过酶结合活性干扰Caspase-8对RIPK3的切割。4.3C蛋白酶切割RIPK3后可能影响了Caspase-8对RIPK3的识别。创新点:1.首次发现EV71和CA6病毒的3C蛋白酶对程序性坏死因子RIPK3具有切割作用。2.首次发现EV71和CA6病毒的3C蛋白酶在切割RIPK3后,影响了Caspase-8对RIPK3的切割。3.首次发现EV71的3C蛋白酶对Caspase-8的干扰现象是通过3C蛋白酶的酶催化活性而不是通过3C蛋白酶的结合活性。