对大部分生命体来说,染色体的复制起始和调节是重要的生命活动。能否正确地进行复制起始决定了细胞的命运。细胞需要在合适的环境下开始复制起始,又必须在恶劣的环境下阻止复制起始。在细菌中,复制起始蛋白DnaA是DNA复制起始过程的关键蛋白。在E.coli中有多种机制来确保染色体正确地复制起始,其中一部分机制是通过调控ATP-DnaA的活性来实现的,包括RIDA(Regulatory inactivation of DnaA)和DARS(DnaA-reactivating sequence)等。DnaA属于AAA+蛋白家族成员,含有保守的Walker A及Walker B motifs。这两个motifs对DnaA蛋白的ATP/ADP结合至关重要。近些年的研究发现,蛋白赖氨酸的乙酰化修饰在细胞的生命活动中扮演着重要的角色。我们的研究表明,DnaA可以在体外被乙酰化酶Pat及乙酰磷酸(acetyl-phosphate,AcP)乙酰化修饰,也可以被去乙酰化酶CobB去乙酰化修饰。为了更好地研究DnaA乙酰化修饰的生理意义,我们通过knock-in的方法在E.coli基因组上dnaA的N-端敲入His标签,并通过亲和纯化的方法获得生理状态DnaA。检测生理状态DnaA乙酰化水平,我们发现E.coli WT菌株中,从迟缓期到平台期,DnaA乙酰化程度逐渐升高。与WT中DnaA乙酰化水平相比,?cobB菌株中DnaA乙酰化水平上升,而?pat菌株中DnaA乙酰化水平下降。AckA为乙酸激酶,可以把乙酰磷酸转化为乙酸;Pta为磷酸转乙酰酶,可以把乙酰磷酸转化为乙酰辅酶A。我们构建了E.coli的ackA-pta双敲株,ackA-pta双敲株的胞内乙酰磷酸浓度较低。我们还发现,?ackApta菌株中平台期DnaA乙酰化水平明显下降。细胞周期分析表明,与WT相比,?cobB、?pat、?ackApta菌株DNA复制起始频率也发生了变化。这表明生理状态下,CobB/Pat及乙酰磷酸都参与调节了DnaA的乙酰化修饰并影响了DNA的复制起始频率。通过LC/ESI/MS鉴定,我们发现生理状态下DnaA的23个赖氨酸位点中有17个位点被乙酰化修饰,其中有位于比较保守的Walker A motif上的K178位,通过质粒互补试验筛选,该位点比较重要。对该位点进行定点乙酰化修饰后检测其功能,发现DnaA(K178Ac)丧失了与ATP及ADP的结合能力,与复制起始点oriC的结合能力有很大程度的减弱。这表明,K178的乙酰化修饰可以降低DnaA的活性。而且DnaA(K178Ac)与dnaA启动子的结合能力也减弱了,这表明DnaA的乙酰化修饰有可能也参与了dnaA基因转录的自调控过程。除此之外,我们还发现K178位的乙酰化修饰可以被CobB去除。以上的发现表明E.coli可以通过调节DnaA的乙酰化修饰来改变DnaA的活性进而对DNA的复制起始频率进行调节。这是一个全新的复制起始调控机制,我们的研究拓宽了人们对原核生物复制起始调控机制的认识。