【摘 要】
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第一章骨活素为绝经后骨质疏松症的关键分子目的基于外周血单核细胞与骨质疏松症的发生发展密切相关,本课题组通过分析绝经后骨质疏松症（Postmenopausal osteoporosis,PMOP）患者外周血白细胞RNA-Seq测序结果,了解PMOP患者外周血单核细胞中基因表达的情况,并通过生物信息学筛选潜在的生物标志物。随后进一步探索目的基因差异表达最显著的单核细胞类型,以期为PMOP的防治寻找新靶
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第一章骨活素为绝经后骨质疏松症的关键分子目的基于外周血单核细胞与骨质疏松症的发生发展密切相关,本课题组通过分析绝经后骨质疏松症（Postmenopausal osteoporosis,PMOP）患者外周血白细胞RNA-Seq测序结果,了解PMOP患者外周血单核细胞中基因表达的情况,并通过生物信息学筛选潜在的生物标志物。随后进一步探索目的基因差异表达最显著的单核细胞类型,以期为PMOP的防治寻找新靶点、新机制。方法对绝经后骨质疏松症患者外周血白细胞进行RNA-Seq测序分析,筛选表达变化差异基因,并对差异基因进行聚类分析和生物信息学分析,筛选出目的基因。随后通过免疫磁珠分选纯化分离外周血单核细胞,并通过qRT-PCR、Western bloting等方法对目的基因在转录和蛋白水平进行检测,筛选出目的基因变化最显著的细胞类型。最后构建卵巢切除（Ovariectomy,OVX）小鼠模型,利用小鼠脾脏悬液中单核细胞对上述实验结果进一步验证。结果基于临床患者外周血白细胞RNA-Seq测序结果,我们共得到差异mRNA 187个（上调131个,下调56个）,并从中筛选到一个与骨代谢密切相关的分子——骨活素（Osteoactivin,OA）。结合患者的临床检查结果,明确OA在PMOP白细胞的表达水平与雌激素和骨密度呈正相关性。与骨量正常组相比,在PMOP患者的外周血白细胞中,CD14+单核细胞中OA的mRNA和蛋白水平的表达均显著下调。进一步的部分结果OVX小鼠模型的单核细胞中也得到验证。结论OA与骨代谢密切相关,并且其表达水平与体内雌激素水平和骨密度呈正相关性。此外,OA在PMOP患者外周血白细胞中显著低表达,CD14+单核细胞为OA表达下调最显著的细胞类型。第二章骨活素调节绝经后骨质疏松症的分子机制目的基于CD14+单核细胞中OA显著下调的研究结果,我们将进一步探讨OA表达水平,对破骨细胞分化、CD4+T细胞活化及其各亚群功能的影响。以期阐明CD14+单核细胞表达的OA通过调节CD4+T细胞活性介导破骨细胞活化,继而引起PMOP进展的分子机制。方法首先将分离纯化后的绝经后妇女外周血CD14+单核细胞,经体外诱导分化后利用qRT-PCR、Western blot等方法,检测CD14+单核细胞OA表达水平对破骨细胞分化和功能的影响;通过CD14+单核细胞与CD4+T细胞共培养,进一步分析CD14+单核细胞OA表达对CD4+T细胞增殖、活化的影响;随后通过流式多因子检测探究绝经后骨质疏松患者CD14+单核细胞OA表达对不同CD4+T细胞亚群分泌细胞因子的影响。结果CD14+单核细胞中OA的表达水平能够影响其自身向破骨细胞分化的能力,胞内OA水平下调时表现为向破骨细胞分化的能力更强。此外,CD14+单核细胞与CD4+T细胞的共培养结果显示,OA表达水平下降时,其对CD4+T细胞活化的抑制作用减弱。雌激素干预、人CD14+单核细胞中OA过表达后,均可逆转上述效应。进一步地流式检测结果显示,活化的CD4+T细胞中IL17和RANKL表达明显升高。结论PMOP患者外周血CD14+单核细胞中OA表达水平,不仅能够影响CD14+单核细胞向破骨细胞分化能力,还能够影响其对CD4+Th17细胞活化的抑制过程。活化后的CD4+Th17细胞中RANKL表达明显升高,并能够进一步促进破骨细胞的分化。本课题初步阐明CD14+单核细胞中OA负向调控RANKL+Th17诱导的破骨细胞异常活化的分子机制。
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