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前言 许多内耳功能障碍与毛细胞受损有关，各种有害因素对毛细胞损伤的最初机制可能相同或相似。人们从各方面进行了大量研究试图阐明其受损机制及找到防护办法，尽管尝试颇多，仍需进一步的研究证实不同因素对内耳毛细胞的影响，进而寻找防治内耳功能障碍的有效方法。本文通过对大鼠耳蜗Corti器进行离体培养，观察非特异性一氧化氮合酶抑制剂L-N~G-硝基精氨酸甲酯(L-N~G -nitroarginine methylester，L-NAME)和钙蛋白酶抑制剂leupeptin对庆大霉素(GM)作用下的耳蜗毛细胞的单独及协同防护作用。 材料与方法 1．动物分组：将20只出生后3-5天的Wistar大鼠(40耳)随机分成5组，每组4只。 (1)组：正常对照 (2)组：只给GM(2mg/ml) (3)组：给GM(2mg/ml)+leupeptin(1mM) (4)组：给GM(2mg/ml)+L-NAME(100μM) (5)组：给GM(2mg/ml)+L-NAME(100μM)+leupeptin(1mM)。 2．主要试剂及设备： 内耳器官培养液，庆大霉素(gentamicin，GM)(Sigma GM-1264)，L-NAME(Sigma-5751)，Ieupeptin(Amresco zJ580)。 内耳器官培养设备 显微图像采集系统 3．方法： 将新生3-5天的Wistar大鼠断头，取出听泡，置于Hanks液中，取出耳蜗，去除血管纹、螺旋韧带，获得全耳蜗基底膜，放入培养液或含处理因素的培养液中培养48h后，用4％多聚甲醛4℃下固定4小时，再用PBS和溶于PBS的1%Triton一Xloo漂洗3次，用TRITC一Phalloidin荧光染色剂染色30分钟后，行全基底膜铺片，荧光显微镜下观察、计数内毛细胞和外毛细胞，各组之间进行比较。所有实验数据以均值*标准差(又士s)表示，用方差分析。实验结果 正常培养48小时的内、外毛细胞保持了良好的形态结构，极少有毛细胞缺失，两保护药物合用组与之相似，二者内、外毛细胞存活率之间无明显差异;单独用一种保护药的两组耳蜗内、外毛细胞的形态破坏加重，毛细胞缺损数量显著增加，与正常对照和两药合用组比较有显著性差异(P<0.01，P<0.01);而只给予GM组的毛细胞基本消失，遗留了大量的瘫痕条纹，内、外毛细胞存活率与单独用药的两组之间亦有显著的差异(P< 0.01，P<0 .01)。讨论 越来越多的证据显示，自由基NO是内耳损伤的重要促成因子。动物注射庆大霉素(GM)可诱导一氧化氮合酶(NOSn)的表达，在耳蜗前庭产生一系列功能障碍，这种作用能被NoS抑制物L一N“一硝化精氨酸甲酷(L一NAME)和过氧化硝酸盐的清除剂依布硒琳(ebselen)所阻断。暴露于GM的豚鼠内耳前庭终器和螺旋器中的部分细胞受到刺激表达诱导型一氧化氮合酶(i NOS)，生成大量NO，同时也产生大量活性物质(ROS)，No.与ROS对细胞均有破坏作用，同时二者发生反应生成氮的过氧化物，它对细胞也有较强的毒性，一般认为在庆大霉素的耳毒性中起重要作用。而经L一NAME，ebselen预先处理后，因前者能竞争性拮抗NOS，减少了NO的产生，后者能清除氮的过氧化物，可以减轻庆大霉素的耳毒性。 细胞内钙和钙缓冲机制也与氨基糖贰类耳毒性有关。有研究显示氨基糖贰类抗生素导致鸟器官型培养的毛细胞中细胞内钙的剂量依赖性增加和急性分离的外毛细胞中细胞内钙的短暂升高。细胞内钙的上升提示GM处理可能导致钙激活蛋白酶的上调，引起细胞骨架、膜蛋白、磷脂酶、激酶、转录因子的崩解，最终导致毛细胞死亡。这种细胞死亡，可被钙蛋白酶抑制剂衰减，如leupe西n。 玩uPePtin是丝氨酸和半胧氨酸样蛋白酶抑制物，能抑制其他细胞中的程序化细胞死亡，被认为是参与凋亡进程的蛋白酶抑制剂。有人提出氨基糖贰类引起内耳损伤的主要原因是造成了毛细胞的凋亡。听感觉细胞的凋亡可通过给予caspase抑制剂或钙蛋白酶抑制剂得到预防。 本研究中应用的两种药物L一NAME和leup叩tin对GM耳毒性后的感觉细胞都提供了显著但不完全的保护作用，存活率上相互间无显著差异。暴露于GM后感觉细胞同时产生NO和ROS，L一NAME几乎完全抑制NO产生，但对ROS作用微弱，leupeptin不能抑制NO和ROS的产生，提示leu-pePtin可能通过调节与细胞内钙有关的凋亡途径来实现其对毛细胞的保护作用。 本研究结果提示，单独阻断NO或单独阻断凋亡途径都不足以对毛细胞提供完全保护，而抑制NO或NOS再加上凋亡途径的阻断显示出有显著的更强烈的保护效应。因此我们考虑是否抑制自由基和阻断凋亡途径二者对毛细胞实现完全保护是缺一不可的。迄今所知，GM不直接促进导致凋亡的程序化细胞死亡进程，推测其细胞内药物的最初作用可能为NO和ROS的产生。而已知NO，ROS和过氧化物导致凋亡，因此推测有可能GM先启动NO和ROS，再导致凋亡的启动。 本实验选择GM作为有害因素，证明L一NAME和leupePtin可对耳蜗毛细胞产生协同保护作用，提示了自由基途径和凋亡程序二者的调节可能对实现完全预防毛细胞损伤都是必要的，为我们防治内耳功能障碍开拓了新思路。结论 L一NAME和leupePtin都分别抑制了GM对耳蜗毛细胞的损伤，而二者联合应用对?