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背景和目的：结核性肉芽肿是结核病的特征性病理改变,结核病的发生、发展和预后与结核性肉芽肿的形成、成熟及液化的病理进程密切相关。巨噬细胞募集活化、淋巴细胞浸润是肉芽肿形成的主要细胞学基础,细胞因子TNF-α、IFN-γ、 IL-12和CCL2等通过调节巨噬细胞、淋巴细胞而参与肉芽肿的形成过程。淋巴细胞、巨噬细胞和细胞因子与肉芽肿形成的关系虽然有大量报道,但其机制仍不完全清楚。本实验通过研究补体系统凝集素途径关键效应酶MASP-2对结核性肉芽肿形成的影响,并揭示其作用机制,为结核病的免疫治疗提供一个新型的靶点和思路。方法：采用Invitrogen公司的BLOK-iTTM表达系统,用Gateway技术进行体外同源重组,重组质粒转染HEK293A细胞进行包装、扩增和构建hMASP-2重组腺病毒。BALB/c小鼠气管注射结核分枝杆菌(BCG5×107CFU/只)建立肉芽肿模型,实验分为四组：①rrAd-hMASP-2重组腺病毒干预组(BCG+rAd-hMASP-2组)；②rAd腺病毒载体对照组(BCG+rAd组)；③模型对照组(BCG组)；④正常对照组(PBS组)。腺病毒(5×107PFU/只)滴鼻干预三次,感染21天后处死小鼠进行检测：①肺组织苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin Staining, H&E)染色,光学显微成像系统采图,Image-Pro Plus 6.0软件计算肉芽肿面积,肺组织齐-尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色；②肺组织匀浆涂布于7H10固体培养基上,37℃恒温培养,18-20天后进行BCG的菌落计数；③实时荧光定量PCR(Fluorescence-based Quantitative Real-time PCR,RT-qPCR)检测hmasp-2、ccl2、 ill2、il8和il6 mRNA相对表达量；④免疫组化(Immunohistochemistry)检测肺肉芽肿组织C4b沉积、CDllb+细胞数和CD3+的细胞数；⑤流式细胞术(Flow Cytometry)检测肺和脾组织中CD3+T细胞、CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的数量及比率；⑥免疫酶联吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测肺、脾和血中IFN-γ和TNF-a的水平。⑦高剂量BCG (1×108CFU/只)感染小鼠,观察rAd-hMASP-2对BCG感染小鼠生存率的影响。结果：1.经PCR和测序验证重组腺病毒rAd-hMASP-2包装成功,并在HEK293A细胞中进行扩增,滴度为109-1010PFU/ml。2.气管注射BCG (5×107CFU/只)感染BALB/c小鼠,第21天在肺部形成典型的结核性肉芽肿病变,建立了BCG感染结核性肉芽肿的小鼠模型。3.与三个对照组相比,BCG+rAd-hMASP-2组检测到hmasp-2 mRNA的表达；并且与BCG+rAd组(光密度值为0.0022±0.0013)相比,BCG+rAd-hMASP-2组肺组织C4b沉积(光密度值为0.0252±0.0129)的面积明显增高(P=0.003),hMASP-2在小鼠肺组织表达并活化裂解C4。4.BCG+rAd-hMASP-2组小鼠生存率为80%,明显高于BCG+rAd组(生存率为50%),hMASP-2能够大大降低BCG感染小鼠的死亡率。5.与BCG+rAd组相比,BCG+rAd-hMASP-2组肺组织肉芽肿面积百分比(30.2%±17.4%)明显增大(P=0.023)；且BCG+rAd-hMASP-2组小鼠肺部荷菌量(3.3×105+4.5×105 CFU/g)显著减低(P=0.005),hMASP-2促进肉芽肿形成减低小鼠肺部载菌量。6.与BCG+rAd组比较,BCG+rAd-hMASP-2组小鼠肺组织淋巴细胞总数(2.56×105±6.41×104个)明显增多(P=0.038)、CD34T细胞数(1.94×104±1.93×103个)显著升高(P=0.037)、CD3+CD8+T细胞数(2.64×103±1.08×103个)明显升高(P=0.042)、且BCG+rAd-hMASP-2组CD3+细胞数(光密度值为0.063±0.0065)和CDllb+细胞数(光密度值为0.0124±0.0032)显著增高,具有统计学差异(P<0.05),hMASP-2促进小鼠肺组织T细胞聚集。7.与BCG+rAd组比较,BCG+rAd-hMASP-2组血清中TNF-α(21.9pg/ml)的含量明显增高(P<0.05)；与BCG组相比,肺组织中TNF-α(521.2pg/ml)的含量明显增高(P<0.05)。肺组织中IFN-γ(158.1 pg/ml)的含量明显高于PBS对照组(P<0.05),hMASP-2很可能促进肺组织免疫细胞分泌TNF-α和IFN-γ。8.与BCG+rAd组相比,BCG+rAd-hMASP-2组il6 mRNA的表达量(1.21)、il12mRNA的表达量(1.86)和c cl2 mRNA的表达(2.07)均上调,而il8 mRNA的表达量(0.57)下调。iMASP-2促进机体分泌IL-6、IL-12和CCL2等细胞因子。结论：1.BALB/c、鼠气管注射5×107 CFU BCG可建立结核性肉芽肿的动物模型。2.重组腺病毒rAd-hMASP-2能够在BCG感染小鼠肺组织表达和活化hMASP-2并裂解补体C4,启动凝集素途径。3hMASP-2能促进BCG感染小鼠肺部肉芽肿的形成、降低BCG感染小鼠肺部荷菌量、提高BCG感染小鼠的生存率。4.MASP-2能够增加肺组织中CD11b+巨噬细胞的数量和促进CCL2、IL-6和IL-12等细胞因子的表达和分泌。表明lMASP-2通过上调趋化因子CCL2,趋化和激活CD11b+巨噬细胞,诱导其分泌TNF-α、IL-6和IL-12等细胞因子,进而促进肺组织肉芽肿的形成、减低肺组织荷菌量、提高小鼠BCG感染生存率。5. hMASP-2能够增加肺组织中CD3+T细胞的数量和促进IFN-γ的分泌,尤其使肺组织中CD3+ CD8+ T细胞亚群数量显著增加,表明hMASP-2能够促进肺组织CD3+CD8+T细胞聚集和活化。在巨噬细胞分泌IL-12参与下,诱导Thl细胞和CTL细胞的免疫应答及促进分泌IFN-γ等细胞因子,进而参与肺组织肉芽肿的形成,增强机体对结核分枝杆菌感染靶细胞的杀伤、减低肺组织荷菌量、提高小鼠BCG感染生存率。