天冬酰胺是植物氮代谢过程中重要的氨基酸,是氮素在植物体内被同化为氨基酸的主要形式,因其相比其他氨基酸有较高的氮碳比、稳定性和溶解性,因此可作为氮素在植物体内长距离运输和贮藏的载体。它既是氨的贮藏者,又是氨的供应者,因此,天冬酰胺含量常常作为很多植物氮营养状况的指示剂,也作为衡量很多植物蛋白质含量的指标。天冬酰胺合成酶以氨或谷氨酰胺及天冬氨酸为底物,催化天冬酰胺的合成,由一个小的基因家族所编码,由于天冬酰胺合成酶在体外及其不稳定,加上提取液里有天冬酰胺酶和该酶的抑制因子的活性,因此,要进一步了解这种合成酶在生理上的功能和特性,往往通过分子生物学技术,对天冬酰胺合成酶基因进行克隆研究。关于杉木天冬酰胺合成酶基因的克隆研究目前还未见报道,因此本研究主要进行杉木幼苗天冬酰胺合成酶基因的克隆和生物信息学分析,以及测定杉木幼苗天冬酰胺合成酶基因在不同生长条件下的表达量,结合测定天冬酰胺含量的变化情况,了解该基因的表达规律及其功能,为进一步探究该基因在氮代谢过程中的作用机制奠定了基础,旨在为今后利用分子生物学技术,改良杉木营养特性,提高杉木养分利用效率,达到速生、丰产、优质的目的提供理论依据。本研究主要研究结果如下:1杉木幼苗天冬酰胺合成酶基因的克隆从NCBI上下载多种植物天冬酰胺合成酶基因的同源序列,设计基因保守片段的简并引物,以杉木幼苗组织为材料,进行RNA提取、逆转录,以合成的cDNA第一链为模板,进行PCR扩增,将得到的目的条带进行割胶回收、连接转化、测序得到一条长度为323bp的保守序列,在NCBI上进行BLAST比对,认为是杉木天冬酰胺合成酶基因的保守片段。根据保守序列设计特异性引物,用RACE技术进行cDNA全长扩增,将最后获得的条带进行拼接,得到一条全长为1609bp的序列,该序列含有一个编码443个氨基酸残基的开放性阅读框,编码框长度为1332bp,另外含有一个 127bp 的 5’UTR,一个 150bp 的 3’UTR 和一个 23bp 的poly(A),起始密码子为ATG,终止密码子为TAA,在NCBI上进行比对,和北美云杉、樟子松、大豆等植物有高度的同源性,因此认为该全长cDNA序列为杉木天冬酰胺合成酶基因。设计编码框引物,PCR扩增得到两条长度相等的编码框序列,翻译成氨基酸后只有第212、400、401、404、435位点编码的氨基酸残基不同,将这两条序列命名为杉木ASN1和杉木ASN2。2杉木幼苗天冬酰胺合成酶基因的生物信息学分析采用生物信息学软件,对克隆获得的两条杉木天冬酰胺合成酶基因的编码框序列杉木ASN1和杉木ASN2编码的氨基酸序列进行预测分析,分析的结果显示,杉木ASN1蛋白和杉木ASN2蛋白的分子式分别为C2223H3414N604O639S18和C2221H3408N6040638S18,两者都为带负电荷的亲水蛋白,且为酸性不稳定蛋白,不含有信号肽,为分泌蛋白,可能都定位于过氧化物酶体中,都为跨膜蛋白。丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)都可能发生磷酸化,且丝氨酸磷酸化的位点更多、概率更高,推测丝氨酸磷酸化位点可能具有调节蛋白构象的作用。蛋白的主要二级结构为无规则卷曲和α-螺旋,三级结构由无规则卷曲和α-螺旋相互盘绕而成,不含有螺旋卷曲结构。两个蛋白的主要功能为参与氨基酸的生物合成,同时也参与转录、翻译以及中间代谢等。通过构建进化树,发现与北美云杉、樟子松、拟南芥、大豆、紫云英、鹰嘴豆、百脉根、苜蓿等有高度的同源性,其中和北美云杉、樟子松的关系较近,与拟南芥和紫云英的亲缘关系较远。根据生物信息学分析的结果,杉木ASN1和ASN2蛋白的理化性质、定位、功能和结构等都相同,因此,认为本试验克隆得到的两条编码框序列同属于一个,基因。3杉木幼苗不同条件天冬酰胺合成酶基因的定量表达在获得杉木天冬酰胺合成酶基因cDNA全长的基础上,设计该基因用于荧光定量PCR的特异性引物,以β-actin为内参基因,采用2-△△CT法进行实时荧光定量PCR试验,分析不同生长条件下,杉木天冬酰胺合成酶基因的表达情况,结果显示:①杉木天冬酰胺合成酶基因在杉木种子浸种24h、种子出芽、胚根伸长、到长成整株幼苗四个生长发育阶段中,相对表达量逐渐增加。②杉木天冬酰胺合成酶基因在干旱胁迫下,短时间内(6h)没有明显变化,胁迫12h后,相对表达量大幅度增加,24h后又有所下降,但仍然高于对照值。③杉木天冬酰胺合成酶基因相对表达量在铝胁迫初期,就表现出显著增加,6h后相对表达量下降,达到稳定状态,但仍然高于对照值。④在光照胁迫和黑暗胁迫12h时,杉木天冬酰胺合成酶基因相对表达量都高于对照值,但是光胁迫的基因表达量远远高于黑暗胁迫的表达量,在胁迫24h后,两种胁迫的基因表达量都下降,光胁迫表达量下降得更明显,黑暗胁迫表达量下降不明显。4杉木幼苗不同条件天冬酰胺含量的测定为了分析天冬酰胺合成酶基因的表达量和天冬酰胺含量的关系,在测定不同条件下杉木幼苗天冬酰胺合成酶基因表达情况的同时,同步测定了天冬酰胺的含量,结果显示:①天冬酰胺含量在杉木种子浸种24h、种子出芽、胚根伸长、到长成整株幼苗四个生长发育阶段中逐渐增加。②在干旱胁迫6h到胁迫12h时,天冬酰胺含量逐渐显著增加,到胁迫24h时含量有所下降,但是仍然高于对照值。③在铝胁迫6h前,天冬酰胺含量逐渐增加,到胁迫12h时含量下降,24h时含量又上升,48h后又有所下降,但都高于对照值。④光照胁迫和暗胁迫12h时,两种胁迫下的天冬酰胺含量都增加,且含量大致相等,胁迫24h时都没有明显变化,到胁迫48h时,含量有所下降,但都高于对照值。结合杉木天冬酰胺合成酶基因的表达量变化和天冬酰胺含量变化情况,推测本试验克隆所得的杉木天冬酰胺合成酶基因可能参与逆境调控,且可能存在多个天冬酰胺合成酶基因共同参与天冬酰胺的合成。