本课题组前期的实验基础是从中药海南地不容（Stephania Hainannensis H.S.Lo et Y.Tsoong）中提取了单体化合物氧化克班宁,并通过体外实验证实了氧化克班宁具有一定的抗肿瘤活性,其敏感细胞株为人乳腺癌MCF-7细胞(IC50值为16.66μmol/L),可以诱导MCF-7细胞发生自噬从而抑制细胞增殖。氧化克班宁为阿朴菲生物碱,有些阿朴菲类生物碱可以通过抑制拓扑异构酶活性,进一步抑制肿瘤细胞DNA的复制解旋等,来达到干扰细胞周期或者抑制细胞生长的作用。拓扑异构酶在DNA的复制和转录起着重要作用,当拓扑异构酶被抑制时可能会引起DNA复制转录等过程受阻从而造成DNA损伤。为了进一步探究氧化克班宁抑制人乳腺癌细胞MCF-7细胞增殖的原因,本论文决定从拓扑异构酶入手做进一步的研究,观察氧化克班宁是否造成人乳腺癌细胞MCF-7细胞DNA损伤。论文应用DNA解旋及k DNA解链试验来探究氧化克班宁对拓扑异构酶的抑制作用。DNA解旋实验结果显示100μmol/L的氧化克班宁能够完全抑制1 U拓扑异构酶Ⅰ的活性,0.5μg p BR322 DNA仍完全呈现超螺旋状态,而25μmol/L的氧化克班宁对于1 U拓扑异构酶Ⅰ的活性已基本没有抑制作用,试验体系中全部的超螺旋DNA均呈现解旋状态。与氧化克班宁对拓扑异构酶Ⅰ的抑制作用程度不同,25μmol/L的氧化克班宁即可完全抑制1 U拓扑异构酶Ⅱα的活性。k DNA解链试验是评价拓扑异构酶Ⅱ活性的专属性实验,与DNA解旋试验结果一致,低剂量（25μmol/L）的氧化克班宁即可完全抑制1 U拓扑异构酶Ⅱα活性。这也进一步验证了氧化克班宁对拓扑异构酶Ⅱα的抑制活性,表明氧化克班宁既能抑制拓扑异构酶Ⅱα介导的DNA松弛,又能抑制拓扑异构酶Ⅱα介导的DNA断裂。实验结果证明,氧化克班宁是拓扑异构酶Ⅰ和拓扑异构酶Ⅱα的双重抑制剂。DNA断裂试验及DNA嵌入试验来探究氧化克班宁抑制拓扑异构酶的具体机制。DNA断裂试验中各浓度的氧化克班宁作用后均未形成线型DNA,因此可知氧化克班宁是拓扑异构酶的催化抑制剂。DNA嵌入试验显示,100μmol/L氧化克班宁能够嵌入DNA使已被拓扑异构酶解旋的超螺旋p BR322 DNA变回超螺旋结构,实验结果表明氧化克班宁是DNA嵌入剂,其嵌入DNA的能力随着给药浓度的增加而升高。论文采用蛋白质免疫印迹方法测定了TopoⅠ、TopoⅡα、γH2AX、ATM、p-ATM、ATR、p-ATR、CHK1、p-CHK1、CHK2、p-CHK2、p-H3蛋白。实验结果显示氧化克班宁能够降低TopoⅠ和TopoⅡα蛋白的表达,且呈剂量依赖趋势。这表明氧化克班宁抑制拓扑异构酶后,细胞中TopoⅠ和TopoⅡα蛋白出现降解。DNA损伤标志蛋白γH2AX的增加同时表明了MCF-7细胞已经因为氧化克班宁参与了MCF-7细胞DNA的合成修复过程造成了DNA损伤,但有趣的是,氧化克班宁并没有像依托泊苷一样激活典型的DNA损伤修复应激通路ATM-CHK1/CHK2,而是增加ATR Ser428位点磷酸化的程度,CHK1总蛋白减少,但其Ser286磷酸化位点蛋白表达升高,CHK2总蛋白量基本无太明显的变化,但CHK2 Thr68位点的磷酸化水平却呈现减少趋势。p-H3是细胞周期中M期的标志性蛋白,因为组蛋白H3的表达只在M期出现,磷酸化H3的增多意味着细胞可能发生细胞周期的改变。综上所述,中药海南地不容中提取的单体化合物氧化克班宁是是拓扑异构酶Ⅰ和拓扑异构酶Ⅱα的双重抑制剂,且能够嵌入DNA是拓扑异构酶Ⅱα的催化抑制剂。氧化克班宁能够进入人乳腺癌MCF-7细胞下调TopoⅠ、TopoⅡα蛋白,造成MCF-7细胞DNA损伤且激活DNA损伤蛋白修复通路ATR-CHK1,抑制CHK2蛋白磷酸化水平,同时增加了组蛋白H3的磷酸化水平。氧化克班宁能通过抑制拓扑异构酶进一步造成人乳腺癌MCF-7细胞DNA损伤,从而影响MCF-7细胞增殖。