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目的:本研究通过检测食管癌高发区食管癌人群组织miR-101基因簇的表达水平、构建大鼠N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（N-methyl-N′-nitro-Nnitrosoguanidine,MNNG）食管损伤模型和过表达细胞模型,来探讨miR-101基因簇和MNNG在食管癌发生发展中的生物学功能和调控机制,为食管癌高发人群的筛检、诊断和预后提供候选生物标志及理论依据。方法1.查询“中国肿瘤登记年报”相关数据,寻找食管癌的高发地区,明确该地区人群食管癌的发病和死亡情况。miRNA基因芯片高通量测序技术基因表达水平检测及miRbase预测miR-101基因簇主要成员;实时荧光定量PCR（RT-q PCR）检测miR-101基因簇（miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p与miR-145-5p）在食管癌患者食管癌组织及其癌旁组织中的表达水平;Logistic回归分析miR-101基因簇与食管癌发病风险的关系,受试者特征曲线（ROC）评价miR-101基因簇对食管癌诊断效力,Fisher精确检验分析miR-101基因簇的表达水平与临床病理资料和生活方式因素之间的关系。采用固相萃取-气相色谱质谱法（SPE-GCMS）检测食管癌病人及其健康对照组尿样中9种N-亚硝胺类化合物的浓度,探究食管癌人群中N-亚硝胺类化合物暴露水平特征。2.将75只健康雄性Wistar大鼠随机分为对照组（生理盐水组）和MNNG亚慢性暴露组（0.08 mg/kg,0.12 mg/kg,0.16 mg/kg和0.20 mg/kg）,连续灌胃90天,染毒结束观察大鼠食管损伤情况,并采用ELISA法检测大鼠血清中白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-6（IL-6）的浓度以探讨炎症反应和大鼠食管损伤的关联性。3.MNNG染毒（0、3和5μg/m L）Eca 109食管鳞癌细胞48 h,RT-q PCR检测MNNG染毒Eca 109后miR-101基因簇的表达水平,流式细胞术、划痕实验评估MNNG对Eca 109细胞的生物学功能的影响;miR-101-3p mimic转染（mimic转染组和阴性对照组）Eca 109食管癌细胞48 h,RT-q PCR检测转染效率,CCK8实验、流式细胞术、划痕实验评估过表达miR-101-3p对Eca 109细胞的生物学功能的影响。4.生物信息学预测miR-101-3p的靶基因及其可能影响的信号通路。Western Blot（WB）技术检测MNNG亚慢性暴露、MNNG染毒Eca 109细胞及过表达miR-101-3p对该信号通路关键蛋白的表达水平,探讨MNNG及过表达miR-101-3p对食管癌可能的调控机制。结果1.中国较具代表性的食管癌高发区甘肃省武威市凉州区2008-2015年间食管癌发病和死亡资料分析显示:该区域食管癌发病率和死亡率长期处于较高水平,且为威胁当地人群健康的主要癌种之一,应作为该区域恶性肿瘤防控的重点;miRNA组织芯片高通量测序结果显示,288种miRNAs和2359种m RNAs在食管鳞癌和癌旁组织中表达有差异,结合miRbase数据库选定miR-101基因簇主要成员为miR-101-3p,miR-125a-5p,miR-127-5p和miR-145-5p;RT-q PCR检测人群样本中miR-101基因簇的表达水平,发现miR-101基因簇在食管癌组织中呈低表达;Logistic回归分析显示,miR-101基因簇的表达水平与食管癌的发病风险呈负相关（OR=0.171、0.247、0.354和0.040,P＜0.05）;ROC曲线分析结果显示,miR-101-3p,miR-125a-5p,miR-127-5p和miR-145-5p诊断的曲线下面积（AUC）为0.726、0.792、0.747和0.800,差异具有统计学意义（P＜0.05）,提示miR-101基因簇在食管癌的诊断中具有一定的效力;临床病理资料结果表明miR-101-3p的表达水平与肿瘤大小显著相关,miR-125a-5p的表达水平与淋巴结转移显著相关（P均＜0.05）;流行病学结果表明miR-101-3p和miR-145-5p的表达与吸烟和进食腌渍食品显著相关（P＜0.05）;尿样研究结果表明,食管癌高发地区食管癌患者尿样中N-亚硝胺类化合物N-亚硝胺类化合物N-亚硝基吗啉（Nnitrosomorpholine,Nmor）和N-亚硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine,Npyr）显著高于健康对照组（P＜0.05）。2.大鼠食管组织病理切片显示,MNNG亚慢性暴露时可导致大鼠食管粘膜广泛糜烂坏死,食管组织结构明显改变,粘膜下可见广泛出血及炎症细胞浸润;炎性因子检测结果显示,与对照组相比,0.12mg/kg,0.16mg/kg MNNG亚慢性暴露组大鼠血清中TNF-α、IL-1β浓度显著升高（P＜0.05）;所有MNNG亚慢性暴露组大鼠血清中IL-6浓度与对照组相比均显著升高（P＜0.05）。3.MNNG对Eca 109细胞生物学功能的影响:RT-q PCR检测结果显示,与对照组相比,5μg/m L MNNG染毒组细胞miR-101基因簇显著下调,差异有统计学意义（P＜0.05）;细胞周期结果显示,与对照组相比,3μg/m L和5μg/m L MNNG染毒组G0/G1期显著降低（P＜0.05）,MNNG 5μg/m L染毒组S期显著降低（P＜0.05）,MNNG 3μg/m L和5μg/m L染毒组G2/M期显著升高（P＜0.05）;细胞划痕结果显示,所有MNNG染毒组Eca 109细胞的迁移能力与对照组相比在24 h和48 h显著上升（P＜0.05）。过表达miR-101-3p对Eca 109细胞生物学功能的影响:RT-q PCR检测结果显示,与阴性对照组相比,mimic转染组中miR-101-3p表达水平均显著升高（P＜0.05）;CCK8结果显示,mimic转染组中miR-101-3p对Eca 109细胞增殖能力在24 h和48 h显著低于阴性对照组（P＜0.05）;细胞划痕结果显示,mimic转染组中miR-101-3p对Eca 109细胞的迁移能力在72 h显著低于阴性对照组（P＜0.05）。4.靶基因预测结果显示,与miR-101-3p相关的基因参与调控79个信号通路（enrichment score＞1.5,P＜0.05）,包括Wnt和PI3K-Akt信号通路。基因集富集分析结果显示,miR-101-3p低表达中最常见的与肿瘤相关信号通路是Wnt-β-catenin信号通路（FDR＜0.25,P＜0.05）。MNNG亚慢性暴露大鼠食管和MNNG染毒Eca 109细胞48 h后,WB结果均显示,与对照组相比,MNNG亚慢性暴露组大鼠食管和MNNG染毒组的Eca 109细胞中β-catenin,p-GSK-3β,CK1,Axin1和TCF7蛋白的表达水平均显著升高（P＜0.05）;mimic转染组Eca 109细胞48h后,WB结果显示,与阴性对照组相比,mimic转染组Eca 109细胞中β-catenin,p-GSK-3β,CK1,Axin1和TCF7蛋白的表达水平显著降低（P＜0.05）。结论1.食管癌为威胁甘肃省武威市凉州区人群健康的主要癌种之一,应该也作为区域性恶性肿瘤防控的重点。miR-101基因簇在当地食管癌患者癌组织中呈低表达,增加miR-101基因簇的表达可以降低食管癌的发病风险;同时,吸烟和进食腌制食品的食管癌患者中miR-101基因簇表达有差异性,因此,研究miRNA的表达可能对食管癌高发区食管癌的诊断、治疗及预后有一定意义。2.MNNG亚慢性暴露可诱发大鼠食管粘膜发生炎症反应,改变食管组织结构,为MNNG亚慢性暴露对大鼠食管损伤调控机制的研究提供了基础。3.MNNG可促进Eca 109细胞的迁移,改变细胞周期比例进而影响食管癌的发生发展过程;同时,过表达miR-101-3p也可显著抑制Eca 109细胞的增殖和迁移,在食管癌中发挥类似抑癌基因的作用,为寻找食管癌早期诊断生物标志物和治疗靶点提供新的理论依据和线索。4.MNNG可通过激活Wnt信号通路来参与食管癌的调控机制,同时,过表达miR-101-3p可通过抑制Wnt信号通路而影响Eca 109细胞的功能,进而影响食管癌发展的进程,为进一步了解食管癌发病机制提供理论依据和线索。