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microRNA(miRNA)是真核生物体内一类具有基因表达负调控功能的非编码小分子RNA,长度短(17-25nt),由带茎环结构的前体剪切而来,高度保守,其表达具有组织特异性和发育阶段特异性,通过互补配对结合并剪切mRNA基因或者抑制mRNA的翻译从而调控基因的表达。它们的作用机理意义深远,并且十分复杂;一条miRNA可以调控多个基因,一条mRNA上也可以有多个miRNA的结合位点。miRNAs参与植物生长发育过程中一系列的重要进程,包括叶片形态形成和极性、根和茎的生长和发育、维管束的发育、花粉的分化和发育及植物生长期向生育期的转变等:参于一些小RNA通路的反馈调节,并可诱导一些siRNA的产生;参于胁迫反应,比如干旱、高盐、植物病毒甚至机械损伤。miRNA、miRNA芯片和测序是最近分子生物学和生物信息学的研究热点,也是商业芯片和商业测序的重点开发项目。
本研究为了研究番茄miRNA对黄瓜花叶病毒侵染的反应以及番茄-病毒互作中与miRNA的相关性,我们采用了高通量的下一代测序技术对两个小分子RNA库进行测序,这两个库一个来自健康番茄植株,另一个来自黄瓜花叶病毒(Cucumber Mosaic Vrus)感染的番茄植株。测序结果表明,两个库里皆有约1300多万条小RNA序列生成。经过一系列筛选过滤后,健康番茄叶子中获得450万条高质量的小RNA序列,而黄瓜花叶病毒侵染的番茄植株中获得约530万条高质量小RNA序列。去除冗余序列后,分别获得32万和30万条特异序列,其中分别又有7151和6812条序列和番茄基因组匹配。最后共有601条miRNA被预测到,其中23个是己知的番茄miRNA,35条在其他植物有报道,属于植物界保守的miRNA,526条miRNA的是新预测的候选基因,是以前从未报道过的。另外我们的实验中还有预测了28条miRNA*。健康番茄叶片与黄瓜花叶病毒侵染的叶片中miRNA差异表达分析表明,深度测序技术可用于病毒感染有关miRNA的检测,进一步的miRNA靶标预测得到很多基因与植物.病原体互作和疾病防御相关。以上结果进一步用荧光定量PCR进行验证,检测了7个miRNA在接种后3个时间点上相对于对照组的变化,得到的结果可以作为植物病毒侵染相关miRNA研究的模型。番茄是植物生长和发育特别是肉质果实发育模式植物之一,病毒引起的番茄植株形态变化与miRNA基因表达调控密切相关,本文得到的结果将为miRNA在植物-病毒互作中的功能研究提供基础。