论文部分内容阅读
背景细粒棘球蚴病是由于感染细粒棘球蚴绦虫的幼虫而引起的一种慢性感染性疾病。该病在世界各地均有感染,给农牧业造成了沉重的负担和给经济造成了巨大损失。我国也是该病的高发地区之一。人感染细粒棘蚴病的主要原因是不幸误食其虫卵引起。被误食的虫卵会在人体的胃、十二指肠内逐渐孵化,释放出六钩蚴,侵入肠黏膜,经血液循环至肝发育为棘球蚴并寄生,引起肝包虫病;有的六钩蚴可通过肝脏,到达肺、脑、骨髓从而引起这些部位的病变。细粒棘球蚴可在人体生存数年至数十年不等。目前,细粒棘球蚴病的治疗方式主要包括手术切除、苯并咪唑(BZ)类药物治疗、经皮下穿刺以及观察(监测非活动性囊肿)。目前首选的治疗方式仍然是手术切除,但是当多个器官出现多个囊肿时或手术禁忌,为了减少复发,依旧需要药物进行相应的治疗。迄今为止,治疗细粒棘球蚴病的首选药物是苯并咪唑类,包括阿苯达唑和甲苯达唑。然而,苯并咪唑类药物在治疗细粒棘球蚴病时会产生较多的副作用,例如胃肠道反应明显,并且吸收效率不高等。此外,BZ作为一种抗寄生虫药,更为明显的不足之处是部分病人经过治疗后仍旧会复发。因此,我们需要开发新的药物的治疗细粒棘球蚴病。目的研究IL-28B对细粒棘球蚴感染小鼠的治疗作用及其免疫机制。方法腹腔注射原头蚴于雌性BALB/c小鼠体内,建立细粒棘球蚴感染模型,感染18周后,用随机法将小鼠分为以下5组:Untreated组:感染原头蚴,建模18周后开始给药,仅给予PBS进行干预。rAd-EGFP组:感染原头蚴,建模18周后开始给药,肌肉注射rAd-EGFP 100μl(10~8PFU/ml),每周给一次药。ABZ组:阿苯达唑(Albendazole),感染原头蚴,建模18周后开始给药,阿苯达唑灌胃,100mg/kg/天。rAd-mIL-28B组:感染原头蚴,建模18周后开始给药,肌肉注射rAd-mIL-28B100μl(10~8PFU/ml),每周给一次药。ABZ+rAd-mIL-28B组:ABZ联合rAd-mIL-28B治疗组,感染原头蚴,建模18周后开始给药,阿苯达唑灌胃,100mg/kg/天,同时肌肉注射rAd-mIL-28B100μl(10~8PFU/ml),每周给一次药。治疗6周后,处死小鼠,计数细粒棘球蚴囊肿个数,称量囊肿重量,计算药物对细粒棘球蚴囊肿生长的抑制率;对肝脏、脾脏进行称重,计算脾脏指数、肝脏指数;对囊肿和肝脏进行HE染色,检测小鼠囊肿和肝脏组织的病理变化;扫描电子显微镜下观察小鼠细粒棘球蚴囊肿囊壁的超微结构;流式细胞术检测脾脏和肝脏T淋巴细胞亚群;ELISA检测血清IL-10、TGF-β、IFN-γ的表达水平和腹腔液中IL-10、TGF-β的表达水平;蛋白芯片法检测血清Th1、Th2和Th17型细胞因子水平。结果ABZ+rAd-mIL-28B可以显著降低细粒棘球蚴囊肿重量,且联合治疗显示出叠加的治疗作用。与Untreated组相比,ABZ+rAd-mIL-28B组(囊肿湿重5.8±1.4g,囊肿生长抑制率55.7%)囊肿湿重显著降低(p<0.05);同时该组抑制率显著高于rAd-EGFP(12.6±4.0g,3.8%)、ABZ单独治疗组(7.1±1.7g,45.8%)(p<0.05)。H&E染色结果显示,Untreated组囊肿的角质层质地均一,结构完整;rAd-mIL-28B组和ABZ+rAd-mIL-28B组小鼠囊肿的角质层明显受到破坏,且外膜出现数量较多的淋巴细胞浸润。用电镜观察囊肿的超微结构,Untreated组囊肿的生发层细胞表面光滑,结构完整;rAd-mIL-28B组和ABZ+rAd-mIL-28B组治疗后的囊肿囊壁的生发层丧失了其完整的细胞结构,细胞呈现一定程度的破裂、皱缩、脱落现象。流式细胞术结果显示,ABZ组(5.64%±1.66%)、rAd-mIL-28B组(4.78%±0.77%)、ABZ+rAd-mIL-28B组(4.53%±0.54%)与Untreated组((8.85%±3.67%))相比较,其小鼠脾脏Foxp3+T细胞百分比出现明显下降(p<0.05)。ELISA结果显示,Th1型细胞因子表达水平明显升高。rAd-EGFP组(5261.22pg/ml±7106.11pg/ml)、rAd-mIL-28B组(6927.72pg/ml±7034.37pg/ml)以及ABZ+rAd-mIL-28B组(2786.49pg/ml±2789.42pg/ml)血清IL-10的表达与Untreated组(646.63pg/ml±559.4 pg/ml)相比,均有明显升高(p<0.05);rAd-mIL-28B组(393.09pg/ml±234.98pg/ml)、ABZ+rAd-mIL-28组(450.34pg/ml±383.41pg/ml)与Untreated组(870.08pg/ml±228.67 pg/ml)相比,血清TGF-β均有明显下降(p<0.05);rAd-mIL-28B组(628.87pg/ml±467.16pg/ml)、ABZ+ABZ+rAd-mIL-28B组(783.89pg/ml±645.42pg/m)血清IFN-γ表达与Untreated组(352.90pg/ml±569.90pg/ml)相比存在明显上升(p<0.05);ABZ组(59.72pg/ml±36.84pg/ml)、ABZ+rAd-mIL-28组(59.39pg/ml±45.44pg/ml))腹腔液IL-10表达与Untreated组(165.11pg/ml±41.58 pg/ml)相比,出现明显下降(p<0.05);与Untreated组(122.14pg/ml±81.09 pg/ml)相比,rAd-mIL-28B组(628.87pg/ml±467.16pg/ml)、ABZ+rAd-mIL-28组(999.76pg/ml±587.60pg/ml)腹腔液中IFN-γ的表达明显上升(p<0.05)。蛋白芯片结果显示,与正常小鼠相比,rAd-mIL-28B组中Th1型细胞因子IFN-γ表达明显增高(p<0.05),Th2型细胞因子IL-4表达出现下降的趋势,Th17型细胞因子IL-17、IL-17F、IL-23等表达明显增高(p<0.05)。结论rAd-mIL-28B治疗后细粒棘球蚴感染小鼠Foxp3+T细胞百分比下降,Th1型细胞因子表达水平升高,说明rAd-mIL-28B可以减少Tregs,下调免疫抑制,增强Th1型细胞免疫应答,从而达到治疗细粒棘球蚴病的效果。