目的目前,珍稀药材沉香的研究欠深入,其活性部位及活性成分不够明确,单体药理活性研究甚少,药材质量标准不完善,2010版药典沉香含测指标仅醇浸出物含量一项,难以科学地评价该常用理气止痛要药的质量。市场上常见假冒伪劣沉香,显著影响了我国人民的医药卫生和身心健康。因此,有必要对沉香进行化学成分、药理活性、质量标准的系统研究。作者拟通过现代化学、药理学、统计学等方法的系统应用,明确沉香的活性部位及活性成分,找出沉香挥发油、醇浸出物、总色酮、色酮单体含量之间的关系,探讨建立沉香质量评价体系的科学方法,从而为沉香质量标准的现代化、规范化以及沉香GAP基地的建设,提供科学依据。内容与方法以加热回流法提取得到沉香醇提液,减压浓缩后依次萃取得到其石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇各部位；运用热板法、醋酸致小鼠扭体法,考察各部位对小鼠镇痛作用的影响,筛选得到沉香镇痛有效部位；以乙醚冷浸法提取沉香挥发油,脱水后常温挥尽乙醚得沉香挥发油(乙醚冷浸物)；采用GC-MS法分析沉香挥发油的化学成分；运用溶剂法、萃取法、沉淀法、结晶法、色谱层析法等对沉香醇提物进行分离；运用理化及光谱法(包括IR, UV、MS、 NMR等)进行化合物的结构鉴定。运用单向灌流模型技术并采用HPLC法同时测定沉香正丁醇部位中Aquilarone A、 Aquilarone B、Aquilarone D、Aquilarone E和(5S,6R,7R,8S)-2-[2-(4-甲氧基-苯基)乙基]-5,6,7,8-四羟基-5,6,7,8-四氢色酮五种色酮衍生物在灌流液中的浓度,进行沉香中五个色酮衍生物的在体肠吸收研究。于37℃、5%C02浓度、饱和湿度下的培养箱中培养PC12细胞,隔天进行换液一次。实验中均取对数生长期的细胞。运用MTT法检测细胞存活率；应用试剂盒-酶标仪法测定细胞内丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽还原酶(GSH-PX)酶活力,研究沉香挥发油及特征性成分的抗氧化损伤活性。参照《中国药典》2010版中沉香性状、显微、显色、醇溶性浸出物及含量测定规定方法,对沉香样品进行初步评价及鉴别；应用磷钨酸钼-硫酸锂显色法对沉香中色酮类成分进行显色,以Aquilarone E作为对照品,采用紫外可见光分光光度法测定沉香总色酮含量。以重量法计算沉香挥发油含量；以高效液相色谱法测定Aquilarone B、 Aquilarone C、Aquilarone D、Aquilarone E和(5S,6R,7R,8S)-2-[2-(4-甲氧基-苯基)乙基]-5,6,7,8-四羟基-5,6,7,8-四氢色酮(CX16)含量,设备与条件为：Waters e2695高效液相色谱仪,Symmetry Shield C18色谱柱(4.6 mmx250 mm,5μm)流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水(B),流速1 mL·min-1,检测波长为252 nm,柱温30℃,进样量10 μL；应用SPSS 19.0统计分析软件,对沉香中挥发油、醇浸出物、总色酮、5个特征性色酮化合物含量进行相关性分析,得出各项指标的内在关系。结果热板法试验中,空白组小鼠痛阈值为23.75s,石油醚组和总浸膏组小鼠痛阈值分别为27.1、29.6 s,两者与空白组差异均有统计学意义(p<0.05),表明沉香醇提液及其石油醚部位对热板法引起的小鼠疼痛有显著抑制作用；扭体法试验中,空白组小鼠15分钟内扭体次数为27.8次,而正丁醇组小鼠扭体次数为20.7次,表明沉香醇提液的正丁醇萃取部位对醋酸引起的小鼠疼痛有显著的抑制作用(p<0.05)。沉香醇提液的石油醚部位和正丁醇部位是沉香镇痛作用的有效部位。沉香挥发油GC-MS分析鉴定了17个化合物,成功检测到沉香中的特征成分苄基丙酮和沉香螺旋醇,还有其他多种倍半萜类成分、脂肪酸类成分、芳香族成分。从沉香的正丁醇部位分离并鉴定了8个特征性色酮化合物。分别为：Aquilarone A、 Aquilarone B、Aquilarone C、Aquilarone D、Aquilarone E、Aquilarone F、 (5S,6R,7R,8S)-2-[2-(4-甲氧基-苯基)乙基]-5,6,7,8-四羟基-5,6,7,8-四氢色酮和一新化合物CX14(该化合物的绝对构型还在进一步确定中)。其中Aquilarone A、Aquilarone D、 Aquilarone E和CX14为同分异构体(目前该同分异构体确定了3种绝对构型,所以CX14为一新化合物)；Aquilarone C和(5S,6R,7R,8S)-2-[2-(4-甲氧基-苯基)乙基]-5,6,7,8-四羟基-5,6,7,8-四氢色酮为同分异构体；所有化合物均具有同一母核,只是取代基数量和位置稍有差异,具体见化合物结构。分别用低、中、高浓度的药物进行灌流时,除结肠外,五种色酮衍生物各浓度的吸收速率常数(Ka)和表观吸收系数(Papp)均无明显的差异(P>0.05)；5种色酮衍生物的Ka、Papp均以空肠和回肠较大,而十二指肠和结肠的较小。LDH法和MTT法检测结果显示,H202对PC12细胞存在明显的抑制作用,经计算得到其IC50为200μmol·L-1; MTT法发现沉香挥发油浓度在34.57μg·mL-1内,随着挥发油浓度的增加,PC12细胞增值加快,超过此浓度细胞生长开始逐渐被抑制,说明沉香挥发油具有一定的细胞毒性；沉香挥发油对H202诱导的PC12细胞氧化损伤保护作用研究中,MTT和LDH检测结果表明：给予200 μmol·L-1 H2O2处理24 h后,细胞存活率明显下降,为56.41%；LDH明显上升,为185.10%；与正常对照组相比,两者均存在显著性差异(p<0.01)；给予沉香挥发油共同处理后,细胞存活率上升至94.62%,LDH降低至56.37%,两者均与模型组存在显著性差异(p<0.01)。沉香挥发油对PC12细胞氧化损伤模型氧化应激水平的影响结果显示：与空白组比较,模型组SOD明显降低,为12.83 U.mL-1,差异具有显著性(p<0.01)；GSH-Px含量明显降低,为27.57μmol·L-1,差异具有显著性(p<0.01)；MDA含量明显升高,为3.58nmol·mL-1,差异具有显著性(p<0.01)；提示H202对PC12细胞具有氧化损伤作用。与模型组比较,给予沉香挥发油干预后,SOD和GSH-Px含量分别升高至22.15 U.mL-1和153.93 μmol·L-1,与模型组对比均具有显著性(p<0.01)；MDA含量降低至0.42 nmol-mL"1,与模型组对比具有显著性差异(p<0.01)；提示沉香挥发油能抑制H202对PC12细胞的氧化损伤作用。色酮单体的抗氧化损伤研究中,MTT结果显示,在625 μg·mL-1内,均未见沉香色酮的细胞毒性,故选择1、10、100 μg·mL-1作为低、中、高浓度进行色酮化合物的抗氧化损伤活性研究；研究结果表明,8个色酮化合物抗氧化损伤活性差异显著。在化合物对H202诱导的细胞增值作用研究中,与空白对照组比较,给予100 μmol·L-1 H2O2处理24 h后,细胞存活率显著性下降至75.19%,LDH显著性上升至164.38%,两者均与空白组存在显著性差异(p<0.01)；给予Aquilarone F共同孵育后,细胞存活率上升至136.46%,LDH下降至68.61%,与模型组对比均具有显著性差异(p<0.01)；给予Aquilarone A、Aquilarone C、CX14、CX16处理后,细胞存活率有所上升而LDH有所下降,但都没有浓度依赖性,提示这些化合物具有抗氧化损伤的作用,但是不存在剂量依赖性；而Aquilarone B、Aquilarone D、AquilaroneE没有抗氧化损伤作用。在化合物对细胞氧化损伤模型氧化应激水平影响研究中,与空白对照组比较,模型组SOD和GSH-Px含量降低至12.68 U.mL-1和41.08 μmol·L-1、 MDA含量升高至3.82 nmol·mL-1,与空白组对照均有统计学意义(P<0.01),提示H202对PC12细胞具有氧化损伤作用。给予沉香色酮化合物干预后,沉香色酮化合物的抗氧化损伤作用差别明显。给予Aquilarone F共同孵育后,SOD和GSH-Px值分别升至23.86 U.mL-1和135.21 μmol·L-1,两者均与模型组存在显著性差异(p<0.01)；而MDA下降至0.37 nmol·mL-1 (p<0.01),提示Aquilarone F有显著的抗氧化损伤作用；给予Aquilarone A、Aquilarone C、CX16处理后,SOD和GSH-Px值都有所上升而MDA值有所下降,但不存在浓度依赖性,提示这些化合物存在抗氧化损伤作用,但作用没有规律,不呈剂量依赖；而Aquilarone B、Aquilarone D、Aquilarone E和CX14没有抗氧化损伤作用。39批沉香药材的显微结果显示,树脂团块为沉香的特征结构,几乎所有的市售沉香都含有此结构,但数量多少存在较大差异；各批药材的醇浸出物含量差别较大,最低的为海南1号沉香,含量仅为1.51%,最高为浙江2号沉香,其含量达34.31%；浸出物的香草醛显色反应也有较大差别,符合药典规定的不多；挥发油含量差别也很大,其中最高为浙江2的41.5%,最低为长沙的0.075%；总色酮含量相对较稳定,介于5.80(海南1药材)和45.06 mg.g-1(对照药材)之间,能较好地反应沉香质量；Aquilarone B、Aquilarone C、Aquilarone D、Aquilarone E和(5S,6R,7R,8S)-2-[2-(4-甲氧基-苯基)乙基]-5,6,7,8-四羟基-5,6,7,8-四氢色酮含量也有很大差异。对20批具有沉香特有香气的药材醇浸出物、挥发油、总色酮及五种色酮含量的相关性分析发现,醇浸出物含量与总色酮、Aquilarone E含量存在显著性相关,相关系数分别为0.696、0.457；总色酮含量与五个色酮含量都存在显著性相关；色酮单体之间也存在较好的相关性,尤其是Aquilarone C、CX16两个同分异构体之间的相关系数达0.932。结论通过系统研究,确定了石油醚部位、正丁醇部位为沉香镇痛活性部位。以乙醚冷浸法结合GC-MS法推断沉香镇痛活性部位-石油醚部位主要为挥发油,并确定了其中17个化学成分。发现另一沉香镇痛活性部位-正丁醇部位以色酮为主,从中分离得到8个特征性色酮同分异构体成分,鉴定出7个成分,另一个新化合物正在形成单晶待鉴定；色酮化合物具有行气止痛和抗氧化损伤活性,因此以Aquilarone B、Aquilarone C、 Aquilarone D、Aquilarone E和(5S,6R,7R,8S)-2-[2-(4-甲氧基-苯基)乙基]-5,6,7,8-四羟基-5,6,7,8-四氢色酮为指标,首次建立了沉香药材单体含测新方法。通过SPSS相关分析法对20批具有沉香香气药材相关指标进行分析,发现沉香醇浸出物含量与总色酮、Aquilarone E含量存在显著性相关,相关系数分别为0.696、0.457；显然,通过沉香各指标的相关性来衡量沉香的药材质量有较高的参考价值。首次建立了综合沉香醇浸出物、有效部位(沉香总色酮、沉香醚浸出物)、有效成分(色酮单体)为指标的沉香质量控制方法,与2010版《中国药典》相比,该法增加了有效部位、有效成分定量指标,为沉香质量控制方法的现代化提供了科学的方法和指标。