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重要的粮食作物水稻是单子叶植物研究的模式植物,其花粉的正常发育与水稻的产量紧密相关。Argonaute(AGO)蛋白是广泛存在于真核生物中的一类高度保守的蛋白家族,它是构成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)的核心组分,也是参与RNA干扰途径的关键因子。水稻(Oryza sativa L.)基因组编码了19个AGO蛋白家族成员,而仅有个别基因的功能被揭示。其中,OsAGO18基因(Os07g0471300)位于水稻的第7染色体,其在水稻花粉发育中的功能尚未见研究报道。在实验室的前期研究中,获得了玉米Ubi启动子驱动的OsAGO18的RNA干涉(RNA interference,RNAi)植株(OsAGO18-RNAi)。表型观察发现,OsAGO18-RNAi植株结实率和花粉育性明显下调,同一花药中的1-2个药室发育异常,部分花药药室的绒粘层降解延迟。以上结果暗示,OsAGO18下调表达影响了花药的正常发育。为了深入探讨OsAGO18调控水稻花粉发育的分子机制,本研究利用生物化学、分子生物学和细胞学等手段对OsAGO18基因在水稻花粉发育中的功能进行了深入探讨。主要研究内容和结果如下:1、对OsAGO18-RNAi植株进行了表型观察,结果显示RNAi植株的花药变短并且卷曲,植株花粉可染率和结实率均明显下降,与先前的观察结果相似。2、通过qRT-PCR和原位杂交方法检测了OsAGO18的时空表达特异性,结果显示OsAGO18在各所检测的所有组织器官中均有表达,但在不同发育时期的根和小穗中表达量较高。通过GUS组织化学染色发现,OsAGO18在不同发育时期的小穗中均有表达。3、花药半薄切片观察结果显示,OsAGO18表达量下调影响了药壁细胞的正常发育和药室形态的正常建成,主要异常包括:花药发育S1-S3时期细胞液泡化、部分花药中有1-2个药室发育成细胞团而停滞以及绒粘层PCD延迟。4、通过TUNEL方法检测了野生型和OsAGO18-RNAi植株花粉发育过程中的PCD信号,结果表明,OsAGO18表达下调导致花药PCD信号紊乱,部分药室凋亡信号提前,部分药室凋亡信号延迟,或者没有凋亡信号。5、实验室前期研究结果显示,水稻AGO家族基因OsAGO1b和OsAGO2下调表达均能导致花粉败育。本研究通过qRT-PCR的方法检测了OsAGO18-RNAi植株中这两个基因的表达,结果表明,OsAGO18-RNAi植株中OsAGO1b和OsAGO2的表达量均明显下调,表明OsAGO18可能调控了这两个基因的表达。6、通过qRT-PCR方法对6个影响水稻花粉发育和花药绒粘层PCD过程的基因,即TDL1、TDR、GAMYB、UDT1、MSP1和MEL1进行了表达量检测,发现OsAGO18-RNAi植株中,TDL1、TDR、GAMYB和UDT1基因的表达量均明显下调,而MSP1和MEL1表达在小穗不同发育时期表达改变并不一致,有的时期表达上调,有的时期表达下调。这些花粉发育相关基因的表达改变,可能是造成OsAGO18-RNAi植株花药发育异常和花粉败育的原因之一。