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目的:探讨间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)外泌体来源的miR-25治疗小鼠1型糖尿病(Type 1 diabetes mellitus,T1DM)的初步分子机制。方法:1.MSCs的分离培养与鉴定。分离培养1周龄C57BL/6乳鼠骨实质来源的MSCs,采用Giemsa染色法观察细胞的形态,流式细胞术检测细胞表型,油红O染色检测细胞体外成脂分化能力,碱性磷酸酶染色检测细胞成骨分化能力,同时并用实时荧光定量PCR(q-PCR)法检测成脂关键转录因子PPAR-γ、C/EBPɑ以及成骨关键转录因子Osteocalcin和Runx2的表达;2.建立小鼠T1DM模型,并分离鉴定MSCs来源外泌体及其miRNA的功能。利用链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导建立小鼠T1DM模型,通过监测小鼠的血糖和体重变化,HE染色、免疫组织化学法和免疫荧光法检测胰腺组织病理学改变和胰岛素分泌等指标鉴定T1DM模型。分别将MSCs(5×10~5/只)由尾静脉输注到T1DM小鼠和正常小鼠体内,48h后分离外周血血清中的外泌体,通过透射电镜观察外泌体的形态,Western blot鉴定外泌体标志物CD63和TSG101的表达。结合实验室前期MSCs外泌体miRNA芯片结果,提取外泌体RNA,采用实时荧光定量PCR(q-PCR)检测血清外泌体中miR-25的表达。利用生物信息学分析预测miR-25与免疫功能相关的靶基因为CXCR3,进一步合成miR-25mimic,瞬时转染CD3单克隆抗体活化的小鼠T细胞,分别采用q-PCR和western blot检测过表达miR-25的活化T细胞中CXCR3的表达;3.初步探讨MSCs外泌体来源miR-25治疗T1DM的分子机制。分别在STZ诱导后的第2、4、6、8d提取T1DM模型鼠的胰腺组织,采用HE染色检测胰岛组织的病理改变,免疫荧光法检测胰腺组织胰岛素分泌和T细胞浸润,免疫组织化学法检测胰腺组织CXCR3的表达,q-PCR检测胰腺组织中趋化因子CXCL9、CXCL10,趋化因子受体CXCR3以及炎症因子TNF-α、IFN-γ的表达,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测外周血血清中炎症因子TNF-α、IFN-γ表达。结果:1.成功分离获得小鼠MSCs。倒置显微镜下观察Giemsa染色后的细胞呈成纤维样、涡旋状贴壁生长,细胞核呈椭圆形,流式细胞术检测细胞表型为Sca-1~+CD29~+CD90~+CD34~-CD45~-CD11b~-MHCII~-,油红O染色结果显示MSCs经成脂分化后细胞中出现大量的红色脂滴,碱性磷酸酶染色检测MSCs成骨分化,可见MSCs诱导组出现大量红色的碱性磷酸酶着色细胞,q-PCR检测结果表明,MSCs诱导组成脂分化关键转录因子PPAR-γ、C/EBPα以及成骨分化关键转录因子Osteocalin和Runx2的表达均显著上调(P<0.01),以上结果证实分离培养的细胞为MSCs;2.成功建立STZ诱导的T1DM小鼠模型,小鼠一般生理状态表现为:体型消瘦,毛发暗淡无光泽,饮水量增多、多尿,体重增长缓慢,血糖显著升高(≥16.7nmol),病理学检测结果表明,HE染色可见小鼠胰岛组织破坏严重,免疫组化和免疫荧光法检测结果显示胰岛素分泌显著减少。将移植MSCs输注T1DM鼠和正常鼠,分离纯化小鼠外周血血清中外泌体,结果表明,分离的外泌体在透射电镜下呈囊泡样杯状结构,大小为100nm左右,Western blot检测结果显示,其表达外泌体标志物CD63和TSG101。采用q-PCR检测MSCs外泌体来源miR-25的表达,结果表明,无论正常对照组还是T1DM组,血清外泌体miR-25表达均显著升高(P<0.01)。生物信息学分析结果发现miR-25的靶基因为CXCR3,为此,采用anti-CD3活化的小鼠T细胞,q-PCR检测检测活化T细胞中CXCR3高表达,进一步合成miR-25 mimic瞬时转染活化T细胞,结果表明,miR-25 mimic可显著下调CXCR3的表达(P<0.001)。上述结果提示,miR-25可以抑制活化T细胞的CXCR3的表达发挥免疫调节功能;3.为探讨MSCs外泌体来源miR-25治疗STZ诱导小鼠T1DM的分子机制,我们初步研究了STZ诱导T1DM发生的病理过程以及T细胞侵润胰腺的时空变化。结果表明,STZ连续5d注射后,胰腺组织HE染色结果显示,胰岛细胞数量的减少与STZ诱导时间呈正相关,至诱导第8d胰岛细胞破坏殆尽。免疫荧光检测结果显示,T细胞向胰腺组织的浸润在STZ诱导后的第4d达高峰,以后逐渐下降,而胰岛数量随时间延长逐渐减少,变化趋势与HE染色相同,免疫组化法检测结果表明,STZ诱导后的第4d CXCR3~+T细胞浸润胰腺组织最多,胰岛细胞大量损伤,以后逐渐减少。q-PCR检测相关趋化因子及其受体的表达,结果显示CXCL9在STZ诱导后第2d即显著升高(P<0.01),其表达具有时间依赖性。CXCL10在第6d达高峰(P<0.01),随后出现下降趋势,趋化因子受体CXCR3在第4d表达至高峰(P<0.01),胰腺组织炎症因子TNF-α、IFN-γ表达逐渐升高,而脾脏组织和血清的TNF-α、IFN-γ的表达无明显变化,提示T1DM早期发生炎症反应主要在胰腺组织。结论:MSCs外泌体来源的miR-25可抑制T细胞CXCR3的表达,T1DM发生过程的早期胰腺中活化的T细胞CXCR3表达最多,上述结果提示MSCs外泌体来源的miR-25可以在T1DM发生早期抑制T细胞的CXCR3表达,减少T细胞向胰腺浸润,从而减轻或治疗T1DM。