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失眠又被称为“不寐”,是常见的慢性临床疾病,中医认为失眠症的主要病位在心,心神被扰或心神失养,神不守舍而成不寐。同时,其他脏腑,如肝、胆、脾、胃、肾的阴阳气血失调,也可扰动心神而致不寐。近年来研究认为,失眠与大脑内中枢神经递质有关,与γ-氨基丁酸(GABA)能神经元系统功能等关系密切。随着微生物组学的发展,有关肠道与口腔的微生物菌群与宿主免疫系统和神经系统调节的研究日益深入,微生物菌群与失眠症的发生进展的关联成逐渐成为研究热点。肝郁血虚型失眠是临床中较为常见的失眠中医证型,四逆酸枣仁合方对治疗肝郁血虚型失眠症具有较好的临床疗效。探究口腔微生态与肝郁血虚型失眠的相关性以及四逆酸枣仁合方的药效机理,有利于揭示肝郁血虚型失眠的相关机制,有利于挖掘肝郁血虚型失眠患者典型中医舌象与失眠症在微生物菌群层面的客观关联性规律,亦有利于揭示四逆酸枣仁合方改善肝郁血虚型失眠的作用机理和新药研发。实验一基于16sRNA的肝郁血虚型失眠患者与健康对照人群的口腔菌群比较研究目的本研究旨在观察与比较肝郁血虚型失眠患者与健康对照人群的口腔菌群生物多样性和菌群结构差异。方法首先收集并筛选出123例临床样本,其中肝郁血虚型失眠患者组76例,健康对照组47例。随后,基于16sRNA的微生物组学技术对临床样本进行测序分析,并利用生物信息学技术分析各组样本的生物多样性、物种组成、多元统计分析等。结果结果表明,两组样本OTU聚类结果共包含14个门和209个属。α生物多样性分析表明,失眠患者的口腔微生物菌群较健康人群更具生物多样性物种组成分析表明,失眠组和对照组的口腔菌群主要分布于14个门的209个属。两组在4个菌门和12个菌属上具有显著性差异。随后进行生物多样性分析,失眠患者的α多样性显著高于健康对照组(Wilcoxon rank-sum test,P<0.05),表明失眠组比健康对照组患者的口腔菌群更具有多样性。LDA Effect Size分析结果表明,两组在15种菌群上具有显著性差异。统计分析方法检验组间(两组或多组)的差异是否显著大于组内差异R值得分为0.084,p值为0.001,表明组间差异大于组内差异,且差异具有显著性。结论肝郁血虚型失眠患者组与健康对照组在生物多样性、微生态物种构成方面具有显著性差异。实验二基于16sRNA的肝郁血虚型失眠患者口腔微生态与中医舌象相关性研究目的本研究旨在观察与比较肝郁血虚型失眠患者中典型舌象的生物多样性和菌群结构差异。方法首先,通过舌象调查,确定舌淡白样本13例,舌紫暗样本16例。基于16sRNA的微生物组学技术对临床样本进行测序分析,并利用生物信息学技术分析各组样本的生物多样性、物种组成、多元统计分析等。结果在门水平,两组样本的优势微生物为厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、梭杆菌门(Fusobacteria);在属水平,两组样本的优势微生物为链球菌属(Streptococcus)、奈瑟菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Rothia)、普雷沃菌属(Prevotella)、纤毛菌属(Leptotrichia)。通过Wilcoxon检验,门水平上,物种丰度大于1%的差异菌群包括变形菌门(Proteobacteria),拟杆菌门(Bacteroidetes),梭杆菌门(Fusobacteria);属水平上,物种丰度大于1%的差异菌群包括奈瑟菌属(Neisseria)、罗氏菌属(Rothia)、普雷沃菌属(Prevotella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、韦荣球菌属(Veillonella)。舌淡白组口腔菌群的α多样性指数略高于舌紫暗组,且差异具有显著性(P<0.05)。PCA降维表明,舌紫暗组样本可形成聚落,而舌淡白组样本相对分散,两组样本的分布可以找到明显的区分线。Anosim分析表明,舌紫暗组与舌淡白组相比,R值为0.169,p值为0.006,表明两组样本组间差异大于组内差异且差异具有显著性。通过LDA Effect Size分析观察两组中15种菌群具有显著性差异的菌群构成。结论肝郁血虚型失眠患者中,舌淡白与舌紫暗舌象的口腔微生态的生物多样性和物种组成差异具有一定的显著性。实验三四逆散合酸枣仁汤治疗肝郁血虚型失眠证的临床疗效观察目的本研究旨在观察比较四逆酸枣仁合方与艾司唑仑治疗肝郁血虚型失眠的临床疗效。方法首先临床收集肝郁血虚型失眠患者60例,并随机分为四逆酸枣仁合方治疗组和艾司唑仑治疗组。通过匹兹堡睡眠指数量表、汉密顿抑郁量表、中医证候调查表,对患者进行服药前后对比。结果合方组临床有效率为83.33%,对照组有效率为86.66%。合方组与西药组患者匹兹堡睡眠质量评分(PSQI)总评分、汉密顿抑郁量表(HAMD)得分结果中,各组内治疗前后结果差异显著(P<0.05),治疗后两组组间比较结果无显著性差异(P>0.05)。结论四逆散合酸枣仁汤治疗肝郁血虚型失眠证具有较好的临床疗效,可以进一步探究其临床疗效及作用机制。实验四 基于网络药理学的四逆散与酸枣仁汤治疗失眠分子机制的比较研究目的对四逆散与酸枣仁汤治疗失眠分子机制进行“活性成分-靶标通路-疾病”的网络药理学比较研究。方法通过检索中药系统药理学分析平台TCMSP等中药化合物数据库构建四逆散与酸枣仁汤的活性化合物数据库,结合机器学习算法进行化合物靶标预测分析,并基于京都基因与基因组百科全书KEGG通路分析、基因本体GO富集分析、治疗靶点数据库TTD疾病关联性分析,运用Cytoscape软件进行四逆散及酸枣仁汤的药理机制复杂网络构建与拓扑分析。结果四逆散得到活性成分145个,柴胡皂苷与山奈酚具有较高的结合活性,靶蛋白1306个,22个显著关联疾病,49个显著性KEGG通路,72个显著性GO富集通路;酸枣仁汤活性成分139个,酸枣仁皂苷与知母皂苷具有较高的结合活性,靶蛋白1386个,52个显著性KEGG通路,84个显著性GO富集通路。结论通过复杂网络图计算与生物信息学分析,在分子生物学层面探讨四逆散与酸枣仁汤治疗失眠的潜在网络药理机制及活性组分,对中医方剂相似性及差异性比较提供新的方法学参考,为进一步揭示中医治疗失眠“同病异治”的机理提供新的思路。