一、研究背景和目的骨转移疼痛是恶性肿瘤骨转移患者的常见症状,严重影响了患者的生活质量。骨转移疼痛由于经常伴有爆发性疼痛,临床上较为难治。目前对骨转移疼痛的治疗方法主要为非甾体抗炎药、环氧化酶-2抑制剂、化疗、放疗、含氮的双膦酸盐类药物以及阿片类药物的单药或多药联合治疗。当患者经过上述治疗后,如果仍然存在疼痛,甚至疼痛程度加重时,需要鉴别未控制疼痛的原因是由于肿瘤进展还是患者对治疗药物或方法无反应或剂量不够。而判断骨转移病变及范围的常规的影像学或放射性核素显像无法精确定量骨损伤的量及速度。因此,需要一种简单的并且能快速和敏感的发现骨骼改变的评估方法,以至于能连续的监测患者的病情进展和评估药物治疗反应。近年来,骨胶原代谢产物——Ⅰ型胶原交联氨基末端肽(NTx)以及Ⅰ型胶原交联碳端肽(CTx)逐步被人们所关注。Ⅰ.型胶原是骨组织中唯一的胶原,占骨基质的90%。研究显示,NTx单独起源于Ⅰ型胶原,并在骨吸收阶段被破骨细胞激活而产生成一个新的表位,具有较高特异性,是破骨细胞溶骨性改变的直接产物,并不会继续代谢。通过采集血清或尿液标本均可分析NTx水平,其中尿液检测无创且易于收集,能反复多次进行,有利于对患者的骨病变进展和疼痛治疗反应进行连续监测。因此,本研究旨在探寻大鼠尿NTx及NTx的增长速度是否与骨转移疼痛及程度相关。并进一步探讨NTx与大鼠骨转移瘤的化疗、双膦酸盐治疗的关系,从而判断尿NTx是否能成为早期发现骨病变进展和评估药物疼痛治疗反应的标记物。在开始上述研究前,我们首先对目前在骨转移疼痛的分子和病理机制以及治疗药物的基础研究中使用的多种动物模型进行总结。并与临床患者情况进行了拟合,以探寻目前常用的动物模型(小鼠和大鼠)与临床骨转移疼痛在疾病类型、骨转移部位、骨转移疼痛部位以及疼痛特点方面是否相符。试图筛选出最贴近临床特点的动物模型开展实验研究,并尝试对筛选出的动物模型进一步优化操作,以发现最贴近临床患者特点、最易于操作、损伤较小的新的骨转移疼痛动物模型。二、研究方法(一)不同骨癌痛动物模型拟合临床特征的研究在Pubmed数据库中检索从1999年到2012年5月的骨肿瘤疼痛动物模型的研究文献进行归纳总结。并采用回顾性研究,纳入2010年5月至2011年3月在华中科技大学附属同济医院肿瘤科住院的骨肿瘤患者以及2010年5月至2012年5月在该院就诊的原发骨肿瘤患者,对患者一般资料、原发肿瘤部位、骨转移部位和骨疼痛相关信息进行统计分析。(二)骨转移疼痛新的大鼠模型：在大鼠股骨第三转子处种植大鼠乳腺癌细胞在我们新建立的大鼠模型中,除了具备第一部分最佳拟合临床的动物模型特点之外,进一步简化操作,减少手术损伤,在大鼠股骨第三转子处注射Walker256细胞。此处的解剖结构相对简单,并且注射钻孔可以垂直进针,仅需破坏皮质骨1-2mm深度,而不损伤远端股骨。在种植术后观察大鼠的疼痛行为和肿瘤生长21天,并进一步研究此模型中神经化学改变。(三)骨代谢标记物NTx与大鼠骨转移疼痛的关系研究1.在新建立的骨转移疼痛大鼠模型基础上,采用随机对照研究,对大鼠股骨种植不同浓度(104个、105个或106个/10μl)肿瘤细胞以造成不同程度肿瘤进展,在种植术前和术后第7天、14天和21天分别测每组大鼠的机械性痛觉过敏缩爪阈值和尿NTx值。2.再对注射相同浓度肿瘤细胞大鼠在种植术后第10天进行唑来膦酸、紫杉醇药物治疗干预和对照研究,在种植术前和术后第7天、14天和21天分别测每组大鼠的机械性痛觉过敏缩爪阈值和尿NTx值。3.并对术后第14天各组大鼠的种植肢行骨切片H&E染色和破骨细胞染色,观察肿瘤侵犯和破骨细胞活性,再进一步检测大鼠脊髓或脊髓背根神经元内c-fos、 TRPV1和ASCI3的表达情况,探讨疼痛与NTx关联的潜在机制。三、研究结果(一)不同骨癌痛动物模型拟合临床特征的研究1.共分析骨肿瘤疼痛动物研究文献26篇,归纳总结成7种不同骨转移疼痛动物模型。2.对骨肿瘤患者的临床分析结果显示,95.3%的骨肿瘤患者为骨转移患者。骨转移疼痛与原发骨肿瘤疼痛在发病年龄、疼痛是否为首发症状以及疼痛类型上均有显著差异。四肢近端骨转移较远端骨更为常见。3.注射转移性肿瘤细胞造模、股骨为成瘤点、测量方法中包含爆发痛测量的动物模型相对能够较好模拟骨转移疼痛临床情况。(二)骨转移疼痛新的大鼠模型：在大鼠股骨第三转子处种植大鼠乳腺癌细胞1.负瘤大鼠在种植术后第14天出现肢体使用评分明显下降,第7天出现自发性缩爪和防卫时间的明显上升,以及在第6天出现机械刺激缩爪阈值的明显下降。2.磁共振成像(MRI)结果显示肿瘤随时间推移而侵犯程度加重,并进一步由骨免疫组化证实了骨转移。3.负瘤大鼠中c-fos和TRPV1阳性神经元数量较对照组明显增加,而P物质(SP)的表达则在两组间无明显差异,提示此肿瘤模型中神经元被激活。(三)骨代谢标记物NTx与大鼠骨转移疼痛的关系研究1.大鼠骨转移疼痛与尿NTx水平相关(r=0.873,p<0.001),而与尿NTx增长速率无关(r=0.265,p=0.181),并且大鼠尿NTx值与唑来膦酸和紫杉醇治疗骨转移疼痛的治疗反应呈正相关(r=0.619,p<0.001)。2.大鼠骨组织切片显示,肿瘤侵犯的范围在各治疗组和肿瘤对照组均无明显区别,但在唑来膦酸治疗组病变内残存骨小梁结构较多,唑来膦酸组的破骨细胞活性明显较肿瘤对照组降低。3.唑来膦酸组的脊髓c-fos和脊髓背根神经节ASCI3的mRNA表达在治疗早期(治疗后第4天)即较肿瘤对照组明显降低,而紫杉醇组的c-fos和脊髓背根神经节ASCI3的mRNA表达较肿瘤对照组降低的差异出现得较晚(治疗后第11天),而各治疗组脊髓TRPV1mRNA表达较肿瘤对照组无明显区别。四、结论(一)注射转移性肿瘤细胞、股骨为成瘤点、测量方法中包含爆发痛测量的动物模型相对能够较好模拟骨转移疼痛临床情况,其研究结果能较为有效的为临床研究和治疗提供参考。(二)在大鼠股骨第三转子处种植大鼠乳腺癌细胞的新的骨转移疼痛动物模型,能成功表现骨转移及疼痛特点,较好拟合临床患者情况,并且手术操作简单,损伤较小。(三)在新建立的骨转移疼痛大鼠模型上进行的骨代谢标记物NTx与大鼠骨转移疼痛的关系研究结果提示,在大鼠模型中,尿NTx值可作为骨转移疼痛、早期发现骨病变进展和评估药物治疗疼痛反应的标记物。