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3-羟基丙酸(3-HP)与乳酸互为同分异构体，是近年来兴起的一种重要平台化合物。与化学法合成3-HP相比，微生物发酵具有操作简单、条件温和、副产物少、生产成本低及绿色环保等优点，显示了较好的应用前景。目前，在微生物体内主要有7条代谢葡萄糖生成3-羟基丙酸的途径被提出，其中，新型β-氧化途径，即 glucose→propionic acid→propionyl-CoA→acrylyl-CoA→β-hydropropionyl-CoA→3-HP被认为是最有前景的一条。前期研究过程中，通过菌种筛选，并结合相关诱变手段，我们获得了一株可直接发酵葡萄糖产3-羟基丙酸的皱褶假丝酵母(Candida.rugosa)突变菌株；发酵初期添加1%(w/v)的丙酸，菌体干重受影响不大，发酵液中3-羟基丙酸可大量积累(达到18 g/L左右)，且丙酸积累有所下降；而对照实验发酵后期3-羟基丙酸仅积累5 g/L左右。我们推测这可能是发酵前期丙酸添加强化了3-羟基丙酸合成途径的代谢通量的结果。结合目前已被揭示的皱褶假丝酵母胞内的丙酸β-氧化途径，我们继续推测3-羟基丙酸代谢通量的强化可能与丙酸调控丙酰辅酶A转化生成丙烯酰辅酶A的酶(丙酰辅酶A脱氢酶)的活力有关。
通过cDNA RACE方法首次克隆了皱褶假丝酵母丙酰辅酶A脱氢酶(PACD)基因全长。首先根据GeneBank已报道的源自其它微生物(如假丝酵母，羧菌等)的酰基辅酶A脱氢酶基因序列高同源区设计简并引物，以皱褶假丝酵母的基因组DNA为模板进行PCR扩增，我们获得了一条大小为514 bp的片段，测序分析和GenBank比对结果证实该片段为皱褶假丝酵母丙酰辅酶A脱氢酶基因中间段序列；根据已扩增的丙酰辅酶A脱氢酶基因中间序列设计特异性引物，采用RACE试剂盒扩增目标基因5’端和3’端，通过测序，我们分别获得了614 bp和820 bp的5’端和3’端；通过拼接中间段、5’和3’端序列，获得了1408 bp的全长cNDA序列；根据cDNA全长序列设计特异性引物进行头尾PCR扩增出PACD的开放阅读框1329 bp，编码442个氨基酸。通过测序以及软件预测，序列包含有两个保守性的活性位点“KHYAEGAGY”和“IHHCMRMIGV”，两个糖基化位点“NISC”和“NHSL”。
采用Invitrogen公司的pPIC9K载体以及相应的Pichia pastoris GS115表达宿主菌株，将目标基因进行异源表达。SDS-PAGE结果显示，重组菌胞内总蛋白在49 kDa处有条特异性的条带出现，而对照没有。通过Ni柱纯化，重组菌P.pastoris(PACD-pPIC9K-6His)在49 kDa处有一条单一的条带，而对照没有，这和软件预测的结果是一致的。Western blotting结果进一步表明，该49 kDa的特异性条带就是重组目的蛋白6His-PACD。
我们对PACD进行动力学参数及酶学性质表征。根据双倒数法作图，通过计算可得出该酶的特征常数：Vmax=1/1.4414=0.693±0.1 U·mg-1·min-1，Km=58.902/1.4414=40.86±5μM，kcat=0.566(s-1)；在其它条件一定下，酶反应速率随温度变化的结果如下：以30℃测得的相对酶活力为100%，在25℃～30℃，活性逐渐增加，30℃达到最大，大于30℃酶活逐渐下降，大于60℃时，酶活几乎降为0；以pH7.0测得的相对酶活力为100%，在pH6.5～7.0之间，酶活逐渐增加，pH大于7.5时酶活逐渐降低；我们考察了常见金属离子对该重组酶的作用，结果显示镁离子对酶有一定的激活作用，钙离子，锰离子等对酶有较弱的抑制作用；该酶在30℃，40℃，50℃下处理2h后相对残余酶活为76.32%，30.11%和4.32%。
通过斑点杂交检测了皱褶假丝酵母胞内丙酰辅酶A脱氢酶在丙酸钠/未添加丙酸钠诱导条件下，不同阶段(12 h，24 h，36 h，48 h，60 h)的mRNA表达状况。首先提取皱褶假丝酵母不同发酵阶段总RNA(同时添加和不添加丙酸钠为对照)并反转录为cDNA，以RACE PCR获得的PACD ORF为探针进行地高辛标记，和各阶段cDNA进行膜杂交。初步获得的结果是：皱褶假丝酵母各发酵阶段总RNA随着发酵时间的增加与PACD探针杂交信号逐渐增强，前期36 h由于处于生长阶段，杂交信号较弱，但48 h之后杂交信号逐渐增强直至稳定；同时，添加丙酸钠各阶段杂交信号明显高于未添加丙酸钠。该结果验证了前期丙酸添加强化代谢通量的推测。
本研究有助于阐明皱褶假丝酵母3-羟基丙酸代谢途径。在葡萄糖产3-羟基丙酸的新型β-氧化代谢途径中，PACD催化关键步骤丙酰辅酶A生成丙烯酰辅酶A，PACD编码基因的克隆及其重组酶酶学性质的测定将有助于进一步了解和优化生物质糖产3-羟基丙酸的代谢过程。
本论文的另外一部分实验针对重组蛛丝蛋白进行了研究。蜘蛛丝是一种天然蛋白质纤维，具有高强度、高弹性、高断裂能等机械性能以及显著的可降解性、组织相容性等生物学特性，在生物医学、材料、纺织和军事装备等领域均有重大潜在应用价值。
通过对蛛丝蛋白原始序列11R26的定点突变(部分序列突变为半胱氨酸、异亮氨酸和赖氨酸)，利用基因工程的手段，大肠杆菌过量表达和AKTA纯化系统Ni柱纯化带有6His标签的重组蛛丝蛋白，获得了突变的重组蛛丝蛋白ZF4/ZF5/ZF6。同时我们通过分子生物学的手段将其基因序列加倍，获得了其高倍体6倍体的大肠杆菌表达产物。在5L发酵罐水平进行发酵优化，使蛋白产量达到1 g/L左右。
将Ni柱纯化的突变体蛋白进行去离子水透析，收集，冰冻干燥机冻干，-80℃保存。将冻干的蛛丝蛋白样品溶于强挥发性有机溶剂六氟异丙醇HFIP，浓度10%(100 mg/ml)，注入1 ml注射器，静电纺丝，扫描电镜观察，结果显示蛛丝蛋白成丝的直径在1～2μm左右。原子力显微镜(HARMONIX模式)检测未突变11R26和突变后的ZF4/ZF5/ZF6纳米纤维机械力学性能，结果显示，突变体ZF4(ser-cys)蛋白丝的硬度比未突变前的蛋白丝硬度提高两倍左右；突变体ZF5/ZF6相对突变前硬度基本没有变化。通过比较蛋白丝纤维的弹性模量变化图，11R26弹性模量变化值大部分分布在小于0.6 GPa区域，最大弹性模量值约为1.385 GPa，平均弹性模量值为0.421左右；ZF4弹性模量值主要分布在0.8以上区域，最大弹性模量值约为2.312 GPa，平均弹性模量值为1.347左右；ZF5弹性模量值主要分布在0.6以上区域，最大弹性模量值约为1.305 GPa，平均弹性模量值为0.913左右；ZF6弹性模量值主要分布在0.8以下区域，最大弹性模量值1.481 GPa，平均弹性模量值为0.585 GPa左右；上述结果说明突变后的ZF4/ZF5/ZF6比突变前蛋白丝的硬度和强度都有了一定提高。通过测定，突变体ZF4的二硫键数目比突变前增加了3.5倍左右，进一步验证了二硫键数目变化引起的力学性能的变化。