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第一部分多功能生物纳米材料的制备、表征及其生物安全性评价目的:1.制备PEG化的载黑色素脂质体(Melanin-based liposome,Lip-Mel),并检测其基本理化性质。2.评估Lip-Mel、空白脂质体(Liposome,Lip)、黑色素(Melanin,Mel)对细胞和动物的毒性。方法:1.用三氯甲烷注入-冷冻干燥法制备Lip-Mel和Lip,并对其粒径、电位等进行检测;用紫外-可见光分光光度法测量其载药量,监测Lip-Mel分散于PBS(phosphate buffer saline)缓冲液不同天数的粒径改变(0天,1天,3天,7天和14天)。2.采用CCK8法检测不同浓度的Lip-Mel(0.00,0.40,0.80,1.20,1.60和2.00 mg/m L)、Lip(浓度与Lip-Mel中的Lip浓度一致)、Mel(浓度与Lip-Mel中的Mel浓度一致)与细胞孵育24小时对细胞的毒性。将BALB/c老鼠(~20 g,4-6周)随机分为13组:对照组、1天Lip-Mel组,1天Lip组,1天Mel组,3天Lip-Mel组,3天Lip组,3天Mel组,7天Lip-Mel组,7天Lip组,7天Mel组,14天Lip-Mel组,14天Lip组和14天Mel组(每组5只),分别经尾静脉注射生理盐水(对照组)、Lip-Mel(100 mg/kg)、Lip、Mel(尾静脉注射后1天、3天、7天、14天)。观察各组老鼠的有无异常行为出现。收集各组血液样本进行血生化分析和血常规分析和重要脏器做病理切片HE染色分析。结果:1.光镜下观察到制得的Lip-Mel呈球形,形态规则,大小均匀,分散度较好。Lip-Mel和Lip粒径分别约为300.5 nm(PDI=0.187)和299.3 nm(PDI=0.104),电位分别为(-42.5±0.935)m V和(-39.4±0.60)m V。紫外-可见光分光光度计检测出Mel的载药量为90.9μg/mg。溶解于PBS(phosphate buffer saline)缓冲液Lip-Mel不同天数的粒径无明显改变。2.高浓度的Lip-Mel和Lip对细胞无毒性,Mel对细胞有低毒性。Lip-Mel、Lip、Mel三组不同天数的血液学指标和重要脏器的病理结果均无明显改变。老鼠行为无明显改变。结论:1.成功制备出球Lip-Mel,结构稳定。2.黑色素经PEG化的脂质体包裹后潜在毒性降低。Lip-Mel、Lip、Mel三者的生物安全性较高。第二部分多功能生物纳米材料用于体内外光声成像和磁共振成像实验研究目的:1.观察Lip-Mel经尾静脉注射后随着时间的推移在各脏器的分布情况。2.体外评估Lip-Mel增强光声成像(Photoacoustic imaging,PAI)、磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)的能力。3.体内评估Lip-Mel增强裸鼠MDA-MB-231荷瘤鼠肿瘤区域光声成像(Photoacoustic imaging,PAI)、磁共振成像(Magnetic resonance imaging,MRI)的能力。方法:1.选取4只MDA-MB-231移植瘤裸鼠经尾静脉注射Di R标记的Lip-Me(10 mg/m L,200μL),进行小动物活体荧光成像,采集注射前,注射后1小时,3小时,6小时,24小时和48小时的图像,测量肿瘤区域的相对荧光强度。注射后24小时解剖一只荷瘤鼠的重要脏器和瘤块,进行离体器官的活体荧光成像。2.用光声成像仪扫描3 mg/m L的Lip-Mel重悬液,扫描波长范围为680 nm-970nm,步长为5 nm以寻找光声成像最适宜的激发波长。用光声成像系统测量每个感兴趣区ROI(region of interest)的光声值。采集不同浓度Lip-Mel重悬液(0-5 mg/m L)的光声成像图。采集3 mg/m L的Lip-Mel重悬液不同时间点的光声成像图。测量每幅图的光声信号值。用综合物性测量系统(Property Measurement System,PPMS)在300开尔文条件下测量Lip-Mel和Mel的磁性能特性。用7.0 T micro-MRI系统(Bruker,Pharmascan)采集不同浓度Lip-Mel重悬液(0-10 mg/m L)(置于2 m L的EP管中)的T1加权磁共振成像图和T1 mapping磁共振图像。测量信号值强度(signal intensity,SI)和弛豫时间T1。3.建立裸鼠MDA-MB-231移植瘤模型3只,经尾静脉注射Lip-Mel(200 m L,10 mg/m L),于注射前和注射后1小时,4小时和24小时采集光声图像,测量光声信号强度。同样的时间点采集T1加权磁共振图像,用Matlab(2016)加伪彩。测量同一层面肿瘤区域的信号强度(SItumor)和大腿肌肉的信号强度(SImuscle)并计算相对信号强度(Relative signal intensity,SIr)信号强度增强率(percentage of signal intensity increase,PSII)结果:1.肿瘤区域的荧光信号强度随着时间的推移而逐渐增强,在注射后24小时达到最强。离体器官的活体荧光显示了肿瘤区域有荧光。2.700 nm是Lip-Mel用来做光声成像最适宜的激发波长。Lip-Mel的光声信号强度呈浓度依赖性,且呈线性改变,单纯的Lip没有光声信号。Lip-Mel的光声信号不会随着时间的推移而改变。Lip-Mel和黑色素的饱和磁化强度分别为0.06 and0.29 emu/g。Lip-Mel浓度越高,T1加权磁共振图像就越亮,其纵向弛豫率r1=0.25m M-1·s-1。3.肿瘤区域的光声信号强度和磁共振信号增强率随着时间的推移逐渐增大。结论:1.Lip-Mel可以蓄积于肿瘤区域实现肿瘤的显像和治疗。2.Lip-Mel光稳定性好,可以实现持续性的光声成像。Lip-Mel能有效增强体内外光声成像和T1加权磁共振成像。第三部分多功能生物纳米材料用于光热消融肿瘤实验研究目的:1.研究Lip-Mel的体外光热性能和通过光热治疗杀死肿瘤细胞和消融肿瘤组织的效果。2.评估光热治疗的安全性。方法:1.用不同功率的808 nm激光辐照不同浓度的Lip-Mel重悬液,水、Lip和Mel作为对照。用1.50 W/cm2和1.00 W/cm2激光辐照Lip-Mel重悬液5分钟,然后关闭激光,自然冷却至室温,像这样激光开关5个循环。1.50 W/cm2激光辐照Lip和Mel 5分钟(其含量与Lip-Mel中各自的含量相同,其中黑色素的含量为363.60μg/m L)。用光热相机采集其温度变化和热像图。2.将不同浓度的Lip-Mel去血清的DMEM重悬液和肿瘤细胞一起孵育12小时,用不同功率的激光辐照,用CCK8评估细胞的活性。用钙黄绿素和碘化吡啶活死细胞染色,通过共聚焦显微镜观察对照组,单纯Lip-Mel组,单纯激光辐照组,Lip-Mel+激光辐照组的细胞活死情况。3.荷瘤裸鼠随机分为4组(6只每组)。第一组是对照组,仅注射生理盐水200μL。第二组是单纯Lip-Mel组,仅注射Lip-Mel 200μL,浓度为10 mg/m L。第三组为单纯激光组,仅注射生理盐水200μL,用808 nm激光辐照10分钟,辐照功率为1.50 W/cm2。第四组为Lip-Mel+激光辐照组,仅注射Lip-Mel 200μL,用808nm激光辐照10分钟,辐照功率为1.50 W/cm2。用红外相机采集肿瘤区域的温度和热像图。用相机隔天拍摄肿瘤的改变,记录肿瘤的体积和裸鼠体重。V/V0(V0:治疗前的原始体积)用以将肿瘤体积标准化。光热治疗后24小时处死一只老鼠,解剖分离其重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤组织,重要脏器进行HE染色,肿瘤组织进行HE染色、TUNEL和Ki67染色。结果:1.温度的上升呈浓度依赖性和功率依赖性。Lip-Mel重悬液在激光辐照关系循环的过程中光热性能没有损耗。Lip-Mel重悬液温度升高了51.5 o C,比单纯的黑色素(ΔT=42.7 o C)和Lip(ΔT=2.4 o C)要高出很多。2.细胞生存率随着浓度的增加和功率的增加而降低。对照组没有死细胞,呈钙黄绿素的绿色荧光;单纯激光组和单纯Lip-Mel几乎没有死细胞,绿色荧光强,碘化吡啶的红色荧光较弱;Lip-Mel+激光辐照组显示红色强荧光,表现为死细胞。3.激光辐照10分钟后Lip-Mel+激光辐照组瘤体温度可以从23.8±1.2°C上升到51.1±2.5°C。单纯激光辐照组的瘤体温度几乎没有上升。光热治疗后2天,Lip-Mel+激光辐照组瘤体区域留下了黑色的疤痕,20天后疤痕消失。其他三组的瘤体正常生长。Lip-Mel+激光辐照组。Lip-Mel+激光辐照组瘤体HE染色切片显示仅有一点蓝色(正常细胞核)和大量大量形态失常的细胞核(核固缩,核碎裂,核溶解),表示大量凋亡和坏死的细胞。TUNEL检测显示Lip-Mel+激光辐照组深棕色的细胞核很多,代表凋亡的细胞,而其他三组比较少。Ki67染色显示Lip-Mel+激光辐照组棕色细胞核最少,代表增值被抑制,其他三组没有表现出抑制肿瘤细胞增值的情况。重要脏器的HE染色切片没有显示出明显的病理改变。结论:1.Lip-Mel显示出良好的光热性能。Lip-Mel光稳定性较好,可重复进行光热治疗。黑色素经脂质体包裹之后提高了光热转换效率。2.Lip-Mel可以通过光热作用杀死肿瘤细胞。3.Lip-Mel可以通过光热治疗高效消融肿瘤。4.光热治疗对裸鼠的健康和重要脏器不会造成明显影响。