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生物素连接酶(BirA)是原核生物和真核生物中广泛存在的—中蛋白酶,又叫生物素乙酰辅酶A合成酶。它是有机生命对一.种必要的维生素—生物素(biotin)的获取不可或缺的一种酶。由于生物素与亲和素(avidin)、链霉亲和素(streptavidin)之间的非共价相互作用异常的高,比抗体对抗原的亲和力要高出100万倍,他们被构建成生物素-亲合素系统(Biotin-Avidin—System,BAS)。通过与目前研究中常用的标记酶(HRP或AKP)、抗体(一抗或二抗)、分离纯化标签(GST、His等)结合,BAS现已被广泛用于微暈抗原抗体定性、定量检测以及定位观察研究,单克隆抗体的标记与分选,多种蛋白的标记、分离与纯化。并且具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、普适性广、操纵和观测简便等一系列有点。生物素—亲和素系统如今已成为研究蛋白分子之间相互作用最重要的方法之一。目前,国内进行生物素—亲和素相互作用研究中所用到的生物素连接酶均来自原核生物。大肠杆菌表达系统尽管有生长周期短、重组子稳定、培养和表达过程简单等优点,但相对于毕赤酵母表达系统,它表达蛋白易形成包涵体、背景蛋白多、表达量低、分离纯化步骤繁杂、蛋白损失较大。由于大肠杆菌需要破菌分离纯化、杂蛋白多、要添加IPTG诱导表达,成本较高,使其不利于工业上的大规模生产。但目前利用毕赤酵母表达系统进行生物素连接酶的表达还尚无相关文献报导。本研究通过查询大肠杆菌基因组中的bira基因序列,合成相应的首尾引物,以大肠杆菌DH5α基因组为模板,通过PCR扩出bira基因,装入大肠杆菌表达载体Pet-23a,并在BirA蛋白N端添加促融标签NUSA后装入改造毕赤酵母表达载体Ppic9k之后得到的载体pHBM905BDM上,然后分别转入E.colirosettla blue和毕赤酵母KM71。在大肠杆菌中成功表达,并首次实现在毕赤酵母KM71中的分泌表达。在大肠杆菌中的表达量分别为78 mg/L,毕赤酵母中摇瓶的表达量为103 mg/L,毕赤酵母发酵罐中带促融标签NUSA融合蛋白的表达量为583 mg/L。NUSA-BirA融合蛋白经TEV酶切并进过His柱子回收后得到的BirA酶的浓度为191 mg/L。在大肠杆菌和毕赤酵母中表达的BirA酶分别用SDS-PAGE、抗生物素biotin的western blot和共聚焦显微镜LCSM中方法进行了验证。经验证,表达的BirA都被证明能高效进行底物的生物素化。