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为了完善植物DNA去甲基化的分子机制,本研究通过两种方法筛选与DNA去甲基化有关的基因,进而研究它们的功能,探索它们参与DNA去甲基化过程的分子机理。方案一:本实验以包含2×35S:LUC(LUC:luciferase)报告基因的拟南芥(Arabsidopsi thaliana)转基因系Col-LUC为遗传筛选的起始亲本材料,将此亲本系进行EMS(Ethyl methanesulfonate)诱变,从自交的M2代群体中筛选到了一株低荧光的突变体,命名为rll2(reducedL UC luminescence 2),此突变对应的野生型基因因此被命名为RLL2。与高荧光的Col-LUC亲本材料相比,rll2突变体荧光强度明显降低。在生长发育方面,rll2突变体有明显的发育缺陷,表现为植株变矮、生长势明显比Col-LUC差。遗传学分析表明,rll2突变体携带一个细胞核单基因隐性突变。图位克隆结果表明,候选基因RLL2定位于5号染色体CL506-B14M1和CL507-B6M1两个分子标记之间,这两个分子标记分别位于 F5024 和 T6G21 两个 BAC(Bacterial Artificial Chromosome)克隆上。Chop-PCR结果表明,rll2突变体中染色体上一些位点的DNA甲基化水平明显升高。RT-PCR(Reverse Transcription PCR)结果显示,rll2 突变体中,RNA 介导的 DNA 甲基化(RNA-directed DNA methylation,RdDM)途径的几个内源靶基因的表达有不同程度的降低。综合以上的研究结果表明,RLL2很可能参与了 DNA去甲基化过程。方案二:本实验利用基因共表达分析方法,筛选出了与ROS1共表达的IDP1(Increase DNA methylation Protein。利用Genotyping和RT-PCR方法,鉴定到T-DNA纯合插入且IDP1功能缺失的纯合突变体。Chop-PCR结果表明,idp1突变体中染色体上一些位点的DNA甲基化水平明显升高。IDP1基因组DNA(gDNA)互补实验表明,idp1突变体中甲基化升高位点的甲基化水平在gDNA/idp1-1互补株系中已经降低了或恢复到野生型水平。GUS染色结果表明,IDP1主要在子叶和花萼片中表达,在子叶中主要表达在叶脉部分。NRPD1A和RDM1是RdDM途径中重要的参与 因 子。通过对 idp1-1/ros1-4、idp1-1/nrpd1a-3、idp1-1/rdm1-4 和 idp1-1/met1(Col-gl)四种双突变体的Chop-PCR分析,表明IDP1确实参与了 DNA去甲基化的过程,且与RdDM途径可能存在拮抗关系。idp1-1/Col-LUC和idp1-1/C24-LUC(Col-4)双突变体的荧光和Kanamycin抗性结果表明,IDP1影响了 Col-LUC和C24-LUC的35S启动子的活性。全基因组DNA甲基化测序结果表明,IDP1和ROS1在参与DNA去甲基化的过程中,在靶位点的选择上存在相似性和差异性。综合以上的研究结果表明,IDP1很可能是一种新的DNA去甲基化的调控因子,它可能与ROS1在同一个遗传途径中,但在靶位点的选择上与ROS1存在差异性。