论文部分内容阅读
本研究以罗非鱼养殖场患病鱼体上分离到的无乳链球菌为疫苗菌株,以乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）为佐剂,采用复乳溶剂挥发法制备PLGA包埋无乳链球菌全菌及菌体超声破碎后上清物的微球疫苗,探讨了粒径适于口服的微球疫苗的制备工艺,测定了微球的包埋和释放特性,最后经口服免疫罗非鱼,研究了罗非鱼对口服缓释微球疫苗的特异性和非特异性免疫反应以及其对罗非鱼的免疫保护效果。主要内容与结果如下：1、无乳链球菌PLGA微球疫苗的制备条件及其特性分析通过控制变量法探讨微球疫苗制备过程中PLGA浓度、PVA（聚乙烯醇）浓度和外水相体积对所制备微球粒径的影响。显微镜观察结果显示随着PLGA浓度、PVA浓度和外水相体积的增加,上清微球平均粒径均随之增大。最终确定上清微球制备条件为PLGA浓度25mg·mL-1、PVA浓度为1mg·mL-1、外水相体积20mL。全菌微球制备条件与上述的相比,仅PVA浓度调整为2mg·mL-1。扫描电镜观察显示全菌和上清微球平均粒径分别为9.4μm和3.9μm,微球均呈球形。BCA法测定包封率分别为68.07%和63.49%；载药量分别为5.49x108个·mg-1和3.58%；28天体外累积释放量分别为64.2%和82.8%。所制备的微球包封率、载药量和缓释效果较好,粒径适于口服,为进一步开展罗非鱼无乳链球菌口服疫苗的免疫效果研究做好准备。2、罗非鱼无乳链球菌PLGA微球口服疫苗免疫保护效果研究分别包埋无乳链球菌全菌和破碎后上清物的PLGA微球,通过灌胃方式口服免疫尼罗罗非鱼,并设注射灭活全菌疫苗为阳性对照,首次免疫后第7、14、21、28天测定受免鱼血液中白细胞吞噬百分比与吞噬指数、血清中溶菌酶与超氧化物歧化酶活性以及抗体水平,28天时人工攻毒实验比较其免疫保护作用。结果显示上清和全菌微球组尼罗罗非鱼的白细胞吞噬百分比与吞噬指数、溶菌酶与超氧化物歧化酶活性均显著高于阴性对照组,但低于阳性对照组；抗体水平也有类似结果,但第14天之后阳性对照组抗体水平开始下降,而上清和全菌微球组则一直维持在较高水平。攻毒实验显示全菌和破碎后上清物微球疫苗相对免疫保护率（RPS）分别为57.63%和34.40%。说明本研究制备的罗非鱼无乳链球菌PLGA缓释微球口服疫苗能够增强罗非鱼对无乳链球菌的免疫反应作用,可为罗非鱼提供一定的免疫保护效果,并可通过缓释作用使机体一直维持较高的抗体水平,但其RPS低于注射灭活全菌疫苗。接下来可以从提高微球剂量入手进一步提高无乳链球菌PLGA微球口服疫苗对罗非鱼的免疫保护率。