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研究背景近年来随着对肿瘤研究的深入,肿瘤微环境的重要性引起了各国政府和学术界的广泛关注。人们逐渐认识到肿瘤组织是由一群异质性的肿瘤细胞亚群所组成,不同的亚群在体内增生和形成肿瘤的能力具有显著差异,其中数量较少的肿瘤干细胞(cancer stemcell,CSC)才有成瘤及维持恶性显型的作用,而CSC又与肿瘤微环境之间存在着密切的联系。正常的微环境可以抑制肿瘤细胞的生长,而异常的微环境则可以促进肿瘤细胞的生长,这就意味着肿瘤的发生机制不仅仅是细胞恶变这一单方面因素,肿瘤微环境在参与调控肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。尽管肿瘤微环境中的各种细胞在肿瘤发生发展过程中均起到一定作用,但肿瘤相关成纤维细胞(tumor associated fibroblasts, TAFs)在这一过程中的作用尤为重要,而骨髓来源间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是TAFs的重要来源之一。肝纤维性病变是肝脏对各种原因所致肝损伤的“创伤愈合”反应,也是肝硬化发生的前奏和必经的中间环节,而肝硬化与肝癌的关系十分密切,但是它们之间的内在关系目前尚不明确,我们猜测肝纤维化很可能是肝癌潜在的诱导因素,但目前关于导致肝纤维化之前的诱发因素即肿瘤(肝癌)发生发展之前微环境变化对在肿瘤促进作用的研究还鲜有报道。研究目的本研究的目的在于探讨外源性致癌剂短时间作用对肝细胞基因表达水平的影响；探索损伤的肝细胞分泌因子是否导致微环境恶性转化以及转化后的微环境对肿瘤成瘤和迁移能力的影响。研究方法1.大鼠间充质干细胞的原代培养和鉴定采用全骨髓贴壁法原代培养大鼠间充质干细胞,并检测其多向分化潜能以及细胞表面标记物。2.外源性致癌物对BRL细胞的作用1)MTT试验摸索黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)对BRL细胞存活率的影响并绘制生长曲线,观察染毒后细胞增殖能力的变化；2)染色体核型分析,检测AFB1染毒对BRL细胞染色体的影响；3)MTT、单细胞凝胶电泳和Hoechst33258染色用来检测DEN对人胎肝干细胞的累积毒性效应；4)实时定量PCR检测AFB1染毒对BRL细胞基因表达水平的影响3.微环境的恶性改变以及其对肿瘤成瘤能力的影响1)建立Transwell共培养模型：模拟损伤肝细胞对间充质干细胞的影响；2)免疫组化检测诱导前后BMSCs α-SMA表达水平的变化；3)软琼脂克隆试验、划痕试验以及细胞侵袭试验评估微环境改变对肿瘤细胞成瘤能力的影响。研究结果1.二乙基亚硝(DEN)对肝干细胞毒性效应人胎肝干细胞经900、1350、1800μg/ml的DEN处理48h后,细胞存活率低于阴性对照组,差异有显著性(P<0.01)；人胎肝干细胞经过DEN处理24h后,出现染色体固缩,浓染等细胞凋亡表现；单细胞凝胶电泳实验发现,当DEN浓度为900和1350μg/ml时,具有致DNA断裂的作用,尾部DNA含量分别达到(18.44±4.99)%和(17.33-3.29)%,明显高于对照组(0.02±0.00)%,差异有显著性(P<0.01),但在浓度为1800和2250μg/ml时,彗星拖尾程度明显降低,差异有显著性(P<0.01)。2. AFB1引起BRL细胞毒性效应MTT显示AFB1剂量为3mmol/L时,BRL细胞存活率为43.59%显著低于对照组100%,差异具有显著性(P<0.05),计算IC50为2.96mmol/L。3.成功培养大鼠间充质干细胞(BMSCs)培养出的BMSCs细胞呈纺锤形或梭形的细胞,形似成纤维样细胞,检测其表面标记物CD29阳性,阳性率为92.5%：CD44阳性,阳性率为65%；CD45为阴性,其阳性率为3.5%,具有成骨、成脂性。4.核型分析AFB1染毒10h后.可观察到BRL细胞染色体出现断裂、裂隙和多倍体等改变。5.定量PCR检测mRNA表达水平检测了经AFB1染毒后的BRL细胞基因表达水平的变化,发现TGF-β、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C和PDGF-D表达量均有不同程度的上调。6.损伤后的BRL细胞对BMSCs的影响利用Transwell小室建立了AFB1染毒后的BRL细胞与BMSCs共培养模型,并且检测到BMSCs的a-SMA表达量上调。7.恶性转化的间充质干细胞对HepG2细胞的影响通过软琼脂克隆试验、划痕试验以及侵袭试验检测发现,诱导后BMSCs可显著增强HepG2的迁徙和侵袭能力。研究结论1.DEN对胎肝干细胞具有直接的毒性效应,引起DNA损伤,具有潜在的遗传毒性。2.AFB1短期处理BRL细胞导致细胞TGF-β和PDGF mRNA表达水平升高,其分泌的细胞因子可以上调间充质干细胞α-SMA的表达。3.BRL细胞非致瘤性损伤可改变微环境,从而增强肿瘤细胞的成瘤、迁徙和侵袭能力。