金属β-内酰胺酶是一种由细菌产生的能够水解已知绝大多数β-内酰胺类抗生素的蛋白酶。抗生素的滥用,导致细菌为应对其所带来的压力,逐步进化产生具有更强水解活性和耐药性更强的金属酶,这种耐药菌的不断增加使金属β-内酰胺酶成为研究和防治耐药菌的热点。因此为探究金属酶在抗生素压力下的生长情况,本文采用一种特制的体外实验装置,通过模拟抗生素环境并使用重组大肠杆菌筛选出具有更强耐药性的金属β-内酰胺酶VIM-1的突变体,利用三维荧光、分子对接等方法研究突变金属酶VIM-1与抗生素的相互作用,以此来探索在抗生素选择压力下金属酶的突变过程,期望为新型抗生素的研制和延缓金属酶的突变以及更好的预防和治疗超级细菌感染提供相应的策略。本文主要内容包括以下几个方面:1设置含有抗生素浓度递增的进化实验装置,该装置分为连续梯度和不连续梯度两种,接种细菌于装置左侧的接种区使其生长迁移,从中挑取菌落进行测序并筛选出点突变和移码突变两种金属酶突变体作为代表,对所获得的突变体进行表达纯化,之后检测突变体的最低抑菌浓度和对抗生素的水解效率。结果发现突变体的最低抑菌浓度大幅度提升,对抗生素的水解效率也提高了10倍左右。2经过两种不同的进化装置实验,我们共筛选出七个突变体,其中在不连续梯度进化装置中有四个突变体,而在连续进化装置中得到三个突变体,并且不连续进化装置中筛选的突变体对抗生素的耐药性总体高于在连续梯度中所得到的突变体;其中不连续进化装置中M2、M3突变体的MICs比野生型提高了256倍,而连续进化装置中的D37H、M4的MICs则提高了128倍。3利用同源建模的方法得到突变体金属酶的三维结构,通过Py MOL软件对比野生型和突变体在整体结构上的差异,并应用三维荧光和圆二色光谱检测金属酶的二级结构,同时研究抗生素与金属酶的分子识别过程。结果表明突变体比野生型二级结构中的α-螺旋含量减少,无规则卷曲含量增加,并且在分子识别过程中野生型VIM-1和突变体的无序结构均有所增加。4对野生型和突变体金属酶进行动力学模拟,以获得其在三维结构上的稳定构象;接着利用Auto Dock软件进行分子对接,分析金属酶与抗生素相互作用的结合键能的种类与数量。发现突变体活性口袋面积相比野生型有所增加,活性口袋暴露,与抗生素相互作用时的键能也增加,这更有利于金属酶与抗生素的结合和水解反应的发生。通过上述实验可知,在抗生素的选择压力下,金属酶确实发生了突变,且这些突变导致金属酶的结构发生变化,进而影响了其水解抗生素的能力,使得耐药性出现不同程度的增强,重组菌的最低抑菌浓度也有所增加,即重组细菌面对抗生素的筛选获得了更高的耐药性。