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溶菌酶(lysozyme,LZM)(E.C.3.2.1.17)是由英国人Fleming在1922年首次在人的鼻黏液中发现。直到1937年Abraham和Robinson从卵蛋白中最先分离出溶菌酶晶体,人类开始了溶菌酶的研究。溶菌酶全称1,4-β-N溶菌酶,又称黏肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它能够切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸间的β-1,4糖苷键间的联结,破坏肽聚糖结构支架,在内部渗透压作用下,细胞胀裂开引起菌体裂解。溶菌酶作为一种广泛分布于自然界的天然蛋白质,有着药理、保健、防腐等功能,应用前景十分广泛。此外溶菌酶还起着清除由其他抗菌蛋白作用细菌后产生的细胞碎片的作用,在免疫防御体系中也起着十分重要的作用。
我们从本实验室构建的家蚕cDNA文库中检索到一条序列,经生物信息学分析发现其蛋白序列与人溶菌酶有38％的同源性,通过PCR的方法从家蚕脂肪体组织cDNA中扩增得到家蚕溶菌酶基因的ORF序列,并将其命名为BmLZM(Bombyxmori lysozyme),GenBank登录号为L37416.1。去除信号肽后该基因序列长为360bp,编码119个氨基酸,预测分子量为13.75 kD。我们将扩增到的BmLZM基因融合多角体(Polyhedrin,Polh)基因后克隆到表达载体pET-28a(+)相应的酶切位点上,在Polh与BmLZM基因间引入一个编码凝血酶(Thrombin,Thb)酶切位点的核酸序列,经过PCR、双酶切鉴定和测序证明了重组子是正确无误的。将该重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3),用终浓度为1 mM的IPTG诱导工程菌后,裂解菌体做SDS-PAGE分析,在45 kD附近的位置有一条特异性蛋白条带,和预期值(His-Tag3.56 kD,Polh29 kD,BmLZM13.75 kD)相符。融合蛋白以包涵体形式存在,故用超声裂解菌体后6,000 rpm离心所得的沉淀以调pH和离心方法纯化融合蛋白His-Tag-Polh-BmLZM。以野生杆状病毒Polh蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔,制备了Polh的多克隆抗体。经纯化后的融合蛋白,用多角体蛋白的多克隆抗体进行Western Blotting检测,确定重组融合蛋白已经成功表达。将纯化后的目的融合蛋白经凝血酶酶切和离心后超滤,得到家蚕溶菌酶蛋白BmLZM。大肠杆菌热激法BmLZM活性检测显示菌悬液明显分为两层,这是大肠杆菌细胞壁被溶解后细胞内含物释放所致,表明得到了有活性的BmLZM。琼脂平板扩散法检测BmLZM蛋白抗菌活性,显示溶壁微球菌的抑菌圈清晰可见。溶壁微球菌比浊法活性检测获得的重组BmLZM的平均酶比活为334.75 U/mg。本研究基于多角体表达技术融合表达、纯化出具有一定生物活性BmLZM,同时为原核表达规模化制备具有抗菌活性类的蛋白物质提供技术手段,可为家蚕溶菌酶相关的基础研究及开发应用奠定基础。