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第一章CXCR4介导足细胞的氧化应激损伤氧化应激在介导足细胞损伤和蛋白尿产生过程中起重要作用,但其机制尚不完全清楚。在本课题中,我们系统地研究了基质细胞衍生因子1(SDF-1)受体,即C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)在介导氧化应激诱导的足细胞损伤中的作用。我们研究发现,在人类伴有蛋白尿的慢性肾脏病患者的肾活检标本中,足细胞上的CXCR4表达显著上调,且其与经典的触发氧化应激的晚期氧化蛋白产物(AOPPs)存在明显共定位。在小鼠阿霉素肾病模型(Adriamycin nephropathy,ADR)中,通过实时定量PCR(qRT-PCR)、免疫印迹(Western blot)以及免疫组化等实验方法和手段,我们发现,阿霉素注射3天起,小鼠肾脏足细胞上的CXCR4表达显著增加,CXCR4的激活伴随着足细胞的氧化应激增加,表现为硝基酪氨酸染色增多;丙二醛(MDA)、NADPH氧化酶的主要亚基NOX2和NOX4表达上调;以及尿液中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)表达增加。通过AOPPs刺激足细胞、分离的大鼠肾小球的离体实验和小鼠负荷AOPPs的氧化应激动物体内模型,我们证实,AOPPs在体外和体内均可引起CXCR4在肾脏足细胞的表达上调,CXCR4的表达上调伴随着显著的足细胞损伤,如足细胞标志蛋白WT1、Nephrin、Podocalyxin等的严重丢失,肌间线蛋白(Desmin)表达明显增加。此外,在ADR诱导的体内和体外模型中,AOPPs可进一步促进CXCR4表达上调,同时伴随更严重的足细胞标志蛋白WT1、Nephrin、Podocalyxin的丢失、蛋白尿水平和肾小球硬化程度。而CXCR4特异性抑制剂AMD3100则能缓解AOPPs引起的小鼠足细胞功能障碍,减少蛋白尿,改善肾小球硬化。上述结果表明,AOPPs介导足细胞损伤与SDF-1/CXCR4信号轴活化显著相关。趋化因子受体CXCR4在介导足细胞的氧化应激损伤、蛋白尿产生和肾小球硬化过程起关键作用。我们的研究同时也阐释了氧化应激引起CXCR4在足细胞表达上调的分子机制。体内外的研究表明,AOPPs可先后依次激活ERK和NF-κB-p65信号通路。阻滞ERK磷酸化可抑制NF-κB-p65信号系统活性。而阻断ERK或p65的活化则均可削弱AOPPs诱导CXCR4在足细胞上调表达的能力,证明氧化应激可能通过MAPK/NF-κB-p65信号通路诱导肾脏足细胞CXCR4表达上调。而过表达CXCR4可显著诱导NAPDH氧化酶的激活和ROS的产生,沉默CXCR4则下调NAPDH氧化酶的活性和ROS的水平。这充分说明氧化应激与CXCR4表达上调以及足细胞损伤三者之间存在恶性循环。总之,我们的研究证明趋化因子受体CXCR4在介导氧化应激诱导的足细胞损伤、蛋白尿产生和肾小球硬化以及肾纤维化中起着至关重要的作用。CXCR4可能是缓解足细胞损伤、蛋白尿和肾小球硬化的新靶点。第二章 CXCR4介导足细胞损伤的机制研究我们前期的研究表明,C-X-C趋化因子4型受体(CXCR4)在介导足细胞氧化应激损伤、蛋白尿产生和肾小球硬化以及肾纤维化过程中起到至关重要的作用。CXCR4可能是减轻足细胞损伤、蛋白尿和肾小球硬化的新的治疗靶点。然而,CXCR4介导足细胞氧化应激损伤的机制仍有待进一步阐明。在本课题中,我们系统地研究了 CXCR4介导足细胞氧化应激损伤的分子机制。我们通过应用实时定量PCR(qRT-PCR)、免疫印迹(Western blot)和免疫荧光染色等实验方法和手段研究发现,在体外培养的足细胞中,CXCR4的特异性配体SDF-1α可诱导active-β-catenin蛋白的表达上调,促进β-catenin转移入核,但β-catenin的上游Wnts分子的表达并没有增加,说明SDF-1/CXCR4信号轴可能通过非Wnt依赖性的途径活化β-catenin。而细胞培养和分离的大鼠肾小球微器官培养实验结果则进一步发现,β-catenin特异性小分子抑制剂ICG-001可显著抑制经SDF-1α刺激后足细胞中β-catenin下游靶基因MMP-7以及Snail表达的增加,同时ICG-001可促使足细胞标志物如WT1、Nephrin、Podocalyxin等的表达上调。说明SDF-1/CXCR4信号轴可能通过激活β-catenin信号通路介导足细胞损伤。更进一步的是,在足细胞中,经特异性配体SDF-1α刺激后,活化的CXCR4可募集支架蛋白β-arrestin1从而形成CXCR4/β-arrestin1/Src信号转导复合物。该复合体可诱导Src、EGFR、ERK、GSK3β的依次磷酸化。而沉默β-arrestin1基因可抑制SDF-1α所诱导的ERK、GSK3β的磷酸化和active-β-catenin的表达上调。同时我们研究发现,在小鼠足细胞特异性敲除CXCR4可显著缓解ADR引起的蛋白尿,改善足细胞功能障碍,减缓肾小球硬化和肾纤维化,这些病理损伤的减缓过程伴随着足细胞β-arrestin 1、p-ERK、β-cateni n及其下游靶基因MMP-7、Snail、PAI-1等分子表达的显著下调。上述结果表明,Src活化后可反式激活EGFR进而诱导ERK磷酸化,ERK活化后则可通过磷酸化GSK-3β导致GSK-3β失活而上调β-catenin。说明SDF-1/CXCR4信号轴是通过募集支架蛋白β-arrestin1形成CXCR4/β-arrestin1/Src信号转导复合物反式激活EGFR及其下游MAPK/GSK3β,抑制β-catenin降解复合体的稳定性与活性,阻止β-catenin的降解,使得细胞内β-catenin蛋白水平升高,随后转位进入细胞核,启动下游靶基因转录,活化的β-catenin信号则可介导足细胞损伤以及由此引起的肾小球硬化以及肾脏纤维化。总之,上述研究结果证明,CXCR4激活后,可通过募集支架蛋白β-arrestin1激活β-catenin信号通路,从而导致足细胞的标志蛋白丢失及足细胞向间充质细胞的表型转化,最终引起足细胞功能丧失和蛋白尿产生。针对足细胞损伤机制的CXCR4/β-arrestin1/β-catenin的小分子靶向治疗可为临床治疗蛋白尿、延缓CKD开辟一条新的途径。