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近年来,乳腺癌的发病率己占所有癌症的7%～10%。乳腺癌是危害女性健康的恶性肿瘤之一。各种因素导致的人体过度的暴露在高水平的激素环境中容易导致乳腺癌的发生,大量的研究表明雌激素及其信号通路在乳腺癌的致病机理中占有重要作用,其中雌激素受体α(ERα)在乳腺癌细胞中发挥着类似癌基因的功能。实验室前期工作筛选到的雌激素受体相互作用蛋白GAB,本文就GAB蛋白对ERα的转录功能调控,以及其上游的miRNA做了以下研究:我们首先利用免疫共沉淀实验验证了 GAB与ERα在细胞内存在相互作用,激光共聚焦实验证明GAB与ERα在细胞核中共定位,这为GAB与ERα的相互作用提供物理基础。我们构建了过表达及敲低GAB的稳定克隆,并在mRNA及蛋白水平上验证克隆构建成功。荧光素酶活性实验验证GAB能够上调ERα的转录活性。为了明确GAB对雌激素信号通路的调节,我们在蛋白水平及mRNA水平上检测ERα及其下游基因的表达情况,结果证明敲低GAB明显抑制ERα及其下游基因的表达。有研究表明雌激素与ERα结合通过核转导途径调控相关蛋白表达调控细胞存活增殖等。生长曲线及克隆形成实验结果表明敲低GAB抑制乳腺癌细胞生长。为了完善GAB在细胞中的调控机制,我们利用软件对靶向GAB的miRNA进行预测并筛选。实验结果发现miR-296-5p能够调控GAB蛋白的表达水平但不影响GAB的mRNA水平,故miR-296-5p是在转录后水平上调控GAB的表达。接着我们在不同的细胞系中检测GAB与miR-296-5p的表达,发现在293T、ZR75-1、MCF7细胞中两者的表达呈一定的负相关。通过软件预测miR-296-5p能够靶向GAB的5’UTR,荧光素酶活性实验表明miR-296-5p通过下调GAB的5’UTR的活性而达到调控GAB蛋白及其下游相关基因的表达。在之前的实验中我们确定了 GAB通过调节ERα而在雌激素信号通路中发挥重要的作用并影响细胞生长。我们发现在乳腺癌细胞中高表达miR-296-5p会使得细胞生长能力和细胞非锚着依赖性生长能力发生抑制,及细胞周期在GOG2其发生阻滞。通过在敲低GAB的乳腺癌细胞中过表达miR-296-5p的生长曲线实验进一步证明miR-296-5p抑制乳腺癌细胞生长是通过靶向GAB实现的。总结:1.GAB作为ERα的共调节因子,通过调节ERα的转录活性功能参与了雌激素信号通路,调控乳腺癌细胞的生长。是雌激素诱导的乳腺癌发生发展中的重要因子;2.miR-296-5p通过靶向GAB的5’UTR调控GAB的表达并参与到雌激素信号通路中,使得乳腺癌细胞周期在G0G2期发生阻滞从而抑制细胞生长。miR-296-5p/GAB的研究丰富了乳腺癌发生发展的理论。