研究背景随着糖尿病发病率的增高,糖尿病创面愈合的困难已逐渐成为创面研究领域内的热点及难点。关于糖尿病创面愈合障碍的机制,至今尚未完全阐明。研究表明巨噬细胞的表型及炎症反应功能可受糖尿病状态的影响,糖尿病创面内也常常伴有异常的巨噬细胞炎症反应状态。关于糖尿病创面的巨噬细胞浸润异常既往已有部分研究涉及,但糖尿病创面愈合过程中不同阶段巨噬细胞的浸润变化情况及炎症反应能力尚未完全阐明。临床研究表明,富血小板血浆(Platelet-rich plasma,PRP)对糖尿病创面的愈合具有较强的促进作用,但具体作用机制尚不明确。通常PRP被用作生长因子的载体应用于创面治疗,但作为血浆和血小板的混合物,PRP对创面愈合的促进作用远不止提供生长因子。研究显示富血小板血浆中含有大量的抗炎症及促炎症物质,对关节炎等炎症性疾病具有较强的控制炎症作用,并且PRP中的主要成分血小板也是炎症及免疫调节的中枢,对巨噬细胞具有较强的调节作用。因此我们提出假设：富血小板血浆对糖尿病创面的愈合促进作用并不局限于提供充足的生长因子,还与调节了糖尿病创面的炎症反应及巨噬细胞功能有关。研究目的采用链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠创面为模型观察糖尿病创面巨噬细胞的浸润变化及富血小板血浆对巨噬细胞浸润变化的影响。研究方法1.糖尿病大鼠创面愈合过程中巨噬细胞的浸润变化以雄性SD大鼠为实验动物,糖尿病组采用链脲佐菌素诱导形成,健康SD大鼠为对照组,每组15只。在大鼠背部形成面积为1cm2为全层皮肤缺损,分别于术后第3、7、14天观察并比较创面的愈合率,同时观察创面组织中CD68+巨噬细胞浸润数量的差异,IL-12B、iNOS、TNF-α的mRNA相对表达量的差异以及创面组织中M1型巨噬细胞CCR7阳性染色的变化。2.富血小板血浆对糖尿病大鼠创面巨噬细胞浸润变化的影响以雄性SD大鼠为实验动物,采用链脲佐菌素诱导造成糖尿病模型,随机分为实验组(非激活PRP组和激活PRP组)以及对照组(生理盐水组),每组各15只。在大鼠背部形成面积为1cm2为全层皮肤缺损,分别涂以非激活PRP、激活PRP、生理盐水0.1ml/创面。于术后第3、7、14天观察并比较创面的愈合率,同时观察创面组织中CD68+巨噬细胞的浸润数量,炎症因子IL-12B、TNF-a及抗炎症因子IL-10mRNA的相对表达量,同时采用体外趋化实验观察PRP对糖尿病大鼠腹腔巨噬细胞的趋化作用,并采用免疫荧光染色法观察共培养条件下巨噬细胞CCR7(M1型巨噬细胞)和CD206(M2型巨噬细胞)的表达情况。研究结果1.糖尿病大鼠创面愈合过程中巨噬细胞的浸润变化术后第3、7、14天时糖尿病大鼠的创面愈合率均低于健康对照组(p<0.05)。HE染色显示第3天时糖尿病组创面组织内的炎症细胞浸润数量低于健康对照组大鼠,而第14天时高于健康对照组；CD68免疫组化染色显示第3天时糖尿病组大鼠创面组织内巨噬细胞的浸润数量低于健康对照大鼠组(p<0.01),而第14天时则明显高于健康对照组(p<0.01)；相关性分析显示第三天时创面巨噬细胞数和创面愈合率呈正相关(r=0.909,p<0.01),第14天时两者间呈负相关(r=-0.962,p<0.01)。糖尿病组创面组织中IL-12B、iNOS、TNF-α的mRNA表达量术后第3天时较健康对照组降低(p<0.05),而第14天时较健康对照组升高(p<0.05)。创面组织CCR7荧光染色显示第14天时仍有较多阳染细胞残留于糖尿病组创面组织内。2.富血小板血浆对糖尿病大鼠创面巨噬细胞浸润变化的影响在术后第3、7、14天时,实验组的创面愈合率均高于对照组p<0.05。其中第3天时激活PRP组明显愈合率明显低于非激活PRP组,p<0.01。而第7和第14天时,激活PRP组创面愈合率高于非激活PRP组,但两者间差异无统计学意义。HE染色结果显示术后第3、7、14天时,实验组创面组内均可见到较多炎症细胞浸润,其中非激活PRP组更为明显。CD68染色结果显示术后第3、7、14天时实验组创面中平均每个高倍视野下巨噬数量比对照组增高,p<0.01,且非激活PRP组较激活PRP组明显,p<0.01。对创面组织mRNA的检测结果显示：术后第3天和第14天时,激活PRP和非激活PRP组创面中炎症因子IL-12B和TNF—α的mRNA表达均较对照组明显下降。两实验组均可有效促进创面抗炎症因子IL-10的表达,其中激活PRP组在术后第7、14天时表达量超过非激活PRP组。体外趋化实验显示在体外高糖培养环境中,PRP对静息腹腔巨噬具有明显的趋化作用,其中非激活PRP的趋化指数除了在10%浓度点低于激活PRP组外,其余浓度点的趋化指数均较激活PRP高,p<0.05。体外共培养后对巨噬细胞爬片的荧光染色结果显示,PRP可以改变促进巨噬细胞CD206(M2型)的表达,其中激活PRP的作用更为明显。研究结论糖尿病大鼠创面愈合过程中巨噬细胞早期进入创面的数量减少,而晚期则持续停留于创面,并且伴有早期减弱晚期增强的炎症反应。PRP可以有效促进糖尿病创面的愈合,趋化巨噬细胞在局部的浸润,并抑制创面炎症因子的表达,促进抗炎症因子的表达,其机制可能与富血小板血浆可以促进糖尿病巨噬细胞向促血管型(M2型)巨噬细胞分化有关,其中激活PRP的作用更为明显。