黑色素瘤是恶性肿瘤中侵袭性、致死性最强的疾病之一,也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一。虽然黑色素瘤在我国发病率较低,但近年来增长迅速,年增长率为3～6%^[1]。除了手术切除早期黑色素瘤病灶疗效确切外,晚期黑色素瘤对常规放化疗抵抗^[2],导致临床效果不乐观,五年生存率低于10%^[3]。由于临床上对晚期黑色素瘤治疗对策十分有限,而且一旦病情恶化,肿瘤生长过快难以遏制,很容易发生全身转移,最后治愈的可能性极低。因此寻找有效的黑色素瘤术后辅助治疗新手段抑制其增殖和侵袭是目前研究的焦点。光动力学治疗（Photodynamic Therapy,PDT）是近年来兴起的一种治疗恶性肿瘤的新模式,局部病灶选择性摄取光敏剂并给予适当波长的光照,通过光敏剂介导和氧分子参与导致氧化损伤,引起靶细胞的凋亡和坏死^[4]。因其几乎没有损伤正常组织细胞的副作用,在临床上具有独特的优势,已经在食道癌、非黑色瘤皮肤癌、宫颈癌等肿瘤的治疗中得到广泛的应用,有望成为多种恶性肿瘤的常规辅助治疗手段^[5-8]。同时光动力学治疗后还可以诱导肿瘤免疫的发生,为一些难治性恶性肿瘤的有效治疗提供新的策略。实验研究发现,PDT可能成为未来黑色素瘤治疗有效的辅助手段^[9],然而PDT对于黑色素瘤增殖和侵袭影响相关报道较少,具体机制尚不清楚,需要进一步研究。本课题以小鼠黑色素瘤细胞B16-F10和人黑色素瘤细胞A375进行研究,研究5-ALA-PDT对黑色素瘤细胞系迁移和侵袭能力的影响及其机制,同时也探查了光敏剂5-ALA促进PDT从而影响黑色素瘤细胞的增殖的相关机制,为光动力治疗黑色素瘤提供理论依据和数据支持。一.ALA-PDT抑制黑色素瘤细胞系A375（人）和B16-F10（鼠）迁移和侵袭及其机制研究:1.ALA-PDT抑制黑色素瘤细胞A375和B16-F10体外迁移和侵袭能力:利用细胞划痕实验检测黑色素瘤细胞迁移能力时发现,2.4J、4.8J ALA-PDT分别处理B16-F10和A375细胞12h及24h后的迁移率相比较空白对照组明显降低（p<0.001）。同时利用Transwell小室实验检测黑色素瘤细胞侵袭能力,结果显示:2.4J、4.8J ALA-PDT处理24h后,B16-F10和A375细胞通过Matrigel基质胶的细胞数量少于空白对照组A375细胞侵袭数目（p<0.001）。2.ALA-PDT处理后,A375、B16-F10自分泌炎症因子mRNA的下调:2.4J、4.8J ALA-PDT分别处理B16-F10和A375细胞12h及24h后对两种细胞自分泌炎症因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-βm RNA水平进行染料q-PCR检测,发现在光动力治疗能量及时间对两种细胞系炎症因子分泌的影响都呈现一定剂量依赖的关系,但仅TGF-βm RNA水平在两株细胞内均有不同程度下调（P<0.05）。3.ALA-PDT处理后,A375、B16-F10自分泌炎症因子蛋白的下调:2.4J、4.8J ALA-PDT分别处理B16-F10和A375细胞12h及24h后对A375、B16-F10自分泌炎症因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β蛋白水平进行ELISA检测,与mRNA定量检测结果一致,光动力治疗能量及时间对两种细胞分泌到胞外炎症因子的水平的影响同样呈现一定剂量依赖的关系,仅TGF-β有不同程度下调（P<0.05）。4.外源性添加TGF-β逆转了PDT对A375、B16-F10迁移和侵袭的能力的抑制:回补10ng/ml TGF-β进行反向验证,分组为:空白对照组、TGF-β组、4.8J PDT组,4.8J PDT+TGF-β组,使用细胞划痕实验检测,结果发现回补TGF-β逆转PDT对A375、B16-F10迁移能力的抑制（P<0.05）;使用Transwell小室检测,结果发现回补TGF-β逆转PDT对A375、B16-F10细胞侵袭能力的抑制（P<0.05）。二、ALA-PDT抑制黑色素瘤细胞系B16-F10增殖及其机制研究:1.随5-ALA剂量增加或延长作用时间,PDT对B16-F10增殖能力的抑制效果越明显:（1）以5-ALA浓度依赖（0、1.25、2.5、5、7.5、10mmol/L）及作用时长（2h、4h、24h）作用于黑色素瘤细胞（B16-F10）,利用CCK-8检测5-ALA不同剂量及不同时长处理B16-F10后,对其增殖无明显影响（P>0.05）,提示其对于细胞本身毒性较弱。（2）以5-ALA浓度依赖（0、2.5、5、10mmol/L）及作用时长（4h、24h）作用于黑色素瘤细胞（B16-F10）,红光635nm照射,利用CCK-8检测细胞增殖能力,发现ALA-PDT却能够显著抑制B16-F10细胞增殖（P<0.05）,并且呈作用时间依赖和剂量依赖。2.5-ALA通过下调自噬相关基因及蛋白表达抑制黑色素瘤细胞自噬:（1）定量qPCR检测5-ALA浓度依赖（0、2.5、5、10mmol/L）及作用时长（4h、24h）作用于B16-F10细胞后,其自噬相关基因（autophagy-related gene,ATG）ATG3、ATG5、ATG7、LC3、Beclin-1 mRNA表达水平下调（P<0.05）,P62 m RNA表达水平下调（P<0.05）;（2）Western blot检测5-ALA浓度依赖（0、2.5、5、10mmol/L）及作用时长（4h、24h）作用于B16、A375细胞后,结果与mRNA水平一致,其自噬相关蛋白ATG3、ATG5、ATG7、LC3、Beclin-1蛋白水平表达显著下调,P62蛋白积累,说明5-ALA处理能够显著抑制B16-F10细胞自噬相关蛋白的表达水平,从而抑制其自噬活性。3.利用雷帕霉素（Rapamycin）诱导黑色素瘤细胞自噬后,逆转了5-ALA对PDT的增敏作用⑴分4组5-ALA（0mmol/L）、5-ALA（10mmol/L）、RAPA（2.5ug/ml）、RAPA（2.5ug/ml）+5-ALA（10mmol/L）处理黑色素瘤细胞（B16-F10）24h,经635nm红光照射后,利用CCK-8检测RAPA+ALA-PDT组相比较于5-ALA（0mmol/L）组增殖无明显差异（P>0.05）;（2）分4组5-ALA（0mmol/L）、5-ALA（10mmol/L）、RAPA（2.5ug/ml）、RAPA（2.5ug/ml）+5-ALA（10mmol/L）处理黑色素瘤细胞（B16、A375）24h后,分别利用定Western blot检测其自噬相关蛋白RAPA+5-ALA共处理组相较于单独RAPA组LC3蛋白表达水平减少（P<0.05）、P62蛋白积累;共聚焦检测自噬小体生成情况,RAPA+5-ALA共处理组相较于单独RAPA组LC3颗粒,数量明显减少（P<0.05）,说明5-ALA抑制了RAPA诱导的自噬水平升高。综上所述,光动力疗法在体外对B16-F10和A375细胞均有明显的抑制迁移和侵袭的作用,其机制可能与其抑制了黑色素瘤自分泌TGF-β有关。同时在增加光敏剂5-ALA剂量后,PDT抑制B16-F10增殖更明显;其机制可能是5-ALA抑制了B16-F10细胞自噬活性所导致的。