研究背景:病原菌的快速准确鉴定和耐药性分析对于人体健康,安全检查和食品安全控制至关重要。提高抗生素药敏实验的时效性是避免抗生素滥用和减少抗生素耐药的关键。临床常规病原菌鉴定和药敏试验依赖于细菌培养的鉴定方法,该方法检测结果准确,但操作繁琐,检测周期超过24小时,尚不能满足临床病原菌快速侦检的实际需求。以分子生物学为基础的鉴定方法如实时荧光PCR已广泛用于检测和鉴定细菌,提高了检测效率,但仍存假阳性和无法区分病原菌生存状态等不足。新型质谱诊断技术简便快速,质谱技术已从实验室研究广泛走向临床微生物的种属鉴定分析,但其检测尚依赖于细菌培养,检测灵敏度有待提高。因此,建立一种简便快速、无标记的细菌鉴定方法,对于临床常见致病菌的有效甄别和耐药性分析、公共安全细菌监测和食品安全检查均具有重大现实意义。拉曼光谱是一种散射光谱,拉曼散射（Raman scattering）是由光照射到物质上产生的非弹性散射,这种非弹性散射改变了入射光子的频率,拉曼散射光和瑞利光的频率之差称之为拉曼位移。拉曼位移取决于生物分子的振动和转动频率,与生物分子的化学键、官能团等相关。因此,拉曼光谱为每一种物质所特有的特征指纹谱,拉曼光谱的峰位置、强度、线宽等特征与物质分子的振动、转动能级相关,提供了生物分子的结构和含量等信息。拉曼光谱在生物分子的定性、定量检测中具有广阔的应用前景,然而,由于分子的拉曼散射截面小、拉曼散射信号微弱,难以直接检测。表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman scattering,SERS）是指入射光在粗糙的类自由电子的金属如金、银、铜等基底表面,激发金属产生表面等离子体共振（surface plasmon resonance,SPR）,在基底表面产生局域等离子体电场增强,进而产生SERS。基于SPR的SERS增强因子可达10⁶-10¹²,因此,SERS具有更高的探测灵敏度、分辨率和信噪比。基于SERS的检测方法在微生物检测相关的食品安全、环境检测和临床诊断等领域已有相关报道。基于SERS的病原菌检测包括标记检测和无标记检测两大类。SERS无标记检测无需拉曼分子标签,提供了病原菌的特征拉曼光谱信息,有望用于病原菌的快速定性检测。SERS增强材料包括金属基底和金属溶胶,其中金属溶胶由于制备简便、成本低、易于保存而广泛应用。银纳米颗粒（silver nanoparticles,AgNPs）对于病原菌的SERS增强性能优越,应用最为广泛。然而,临床病原菌的鉴定缺乏标准的病原菌拉曼光谱数据库,病原菌的拉曼位移峰的归属尚不明确,无标记SERS技术对于致病菌的耐药性分析更是鲜有报道。综上所述,本研究针对临床对于病原菌快速检测和耐药性分析的迫切需求,结合SERS技术、多变量统计分析和机器学习方法等,探索不同纳米材料检测病原菌的表面增强拉曼散射效应（SERS效应）,建立基于AgNPs的SERS检测方法,结合多变量统计分析,用于临床常见病原菌种属鉴定和耐药性分析。进一步采用机器学习方法,建立判别分析模型,对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）进行判别分析,寻找MRSA与甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌（methicillin-sensitive Staphylococcus aureus,MSSA）的差异特征,在金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,S.aureus）的耐药菌株差异特征分析做了初步探讨,有望为病原菌的快速检测提供新方法。研究目的:本研究拟构建简便、无标记的基于AgNPs⁺的SERS检测方法,结合多变量统计分析和机器学习方法,用于S.aureus的种属鉴定、临床MRSA菌株的判别分析以及筛选MRSA的差异分子,为临床感染性疾病快速诊断、避免抗生素滥用、减少抗生素耐药提供新的思路和新的方法。材料与方法:1.不同种类纳米材料用于病原菌检测的SERS效应研究（1）合成纳米材料,包括金银纳米核壳复合（gold-silver nano-core shell composite material,AuNR@Ag）材料、金纳米三角片-金纳米颗粒复合物（gold nano-triangle-gold nanoparticle composite,TAuNPs-AuNPs）及AgNPs胶体溶液。（2）不同纳米材料及其与S.aureus结合前后的表征,包括紫外-可见光（ultraviolet-visible absorption spectrum,UV-Vis）、扫描电镜（scanning electron microscopy,SEM）、透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）、Zeta电位、粒径分析、能谱分析的表征（energy dispersive spectrometer analysis,EDS）。（3）验证不同纳米材料检测病原菌的SERS效应。2.基于AgNPs⁺的SERS检测病原菌的方法学评价（1）基于AgNPs⁺的SERS检测S.aureus的条件优化。（2）基于AgNPs⁺检测S.aureus的SERS效应验证。（3）基于AgNPs⁺的SERS检测S.aureus的方法学评价,包括灵敏度、特异性、重复性等方法学指标的评价。3.基于AgNPs⁺的SERS检测技术用于病原菌的种属区分和耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA）的检测（1）菌株的收集和菌液的制备,包括床菌株的收集、鉴定和药敏试验以及标准菌株的复苏。（2）不同种属病原菌以及临床MRSA菌株的拉曼光谱检测。（3）基于多变量统计分析不同种属病原菌以及MRSA的拉曼光谱数据。（4）基于机器学习方法,建立和评价MRSA的判别分析模型。研究结果:1.不同种类纳米材料用于病原菌检测的SERS效应研究（1）成功的制备了AuNR@Ag核壳材料、AuNR@Ag SERS基底,以及带正电的银纳米颗粒（positively charged silver nanoparticles,AgNPs⁺）和带负电的银纳米颗粒（negatively charged silver nanoparticles,AgNPs^-）。（2）AuNR@Ag基底检测可获得了细菌的特征谱,但AuNR@Ag基底的空白信号对细菌的特征谱有覆盖。Q-SERS对拉曼报告基团的增强效应显著,报告基团的特征峰明显。但Q-SERS基底对于细菌检测的增强效应不显著。（3）AgNPs⁺通过静电结合,紧密包裹到细菌表面。AgNPs对于细菌检测的增强效应显著。AgNPs⁺增强效应比AgNPs^-显著。2.基于AgNPs⁺的SERS检测病原菌的方法学评价（1）实验条件优化为AgNPs⁺与S.aureus的孵育时间为30 min,AgNPs⁺与S.aureus的体积比为1:1,S.aureus的菌液配置缓冲液为超纯水,AgNPs⁺的粒径选取65 nm。（2）成功建立了基于AgNPs⁺的SERS检测方法。验证了AgNPs⁺检测S.aureus的SERS效应。AgNPs⁺增强因子达10⁷,AgNPs⁺在730 cm^-1的峰强度比AgNPs^-的强3.4倍。（3）基于AgNPs⁺的SERS检测方法可探测单个S.aureus的拉曼光谱信号。采用分离培养和拉曼光谱的多变量统计可区分S.aureus与其他属病原菌。该检测方法的重复性在可接受范围内,批内相对标准偏差（relative standard deviation,RSD）为12.7%,批间RSD为14.31%。该方法成功用于临床样本中的S.aureus检测。3.基于AgNPs⁺的SERS检测技术用于病原菌的种属区分和MRSA的检测（1）细菌与真菌的拉曼光谱峰位置、峰强度差异显著。革兰阳性菌和革兰阴性菌的拉曼光谱的拉曼峰位置、峰强度具有明显差别。组成分分析（principal component analysis,PCA）或偏最小二乘法判别分析（latent structure discriminant analysis classification,PLS-DA）可区分不同属病原菌。正交偏最小二乘法判别分析（latent structure discriminant analysis classification,OPLS-DA）S.aureus与其他属的差异变量主要位于721-735 cm^-1、1316-1322 cm^-1、647-656 cm^-1、1618-1626 cm^-1等拉曼位移处。（2）同属不同种或不同株之间的拉曼光谱肉眼无法直接区分。PCA或层次聚类分析（Hierarchical clustering analysis,HCA）可区分同属不同种、不同株病原菌的拉曼光谱。PLS-DA分析S.aureus 29213与S.aureus 25923的差异特征主要分布在729-735cm^-1和1319-1335 cm^-1。（3）MRSA与MSSA的拉曼光谱谱峰的位置、强度和相对强度比例可见差异。MRSA在727-730 cm^-1、1322-1325 cm^-1拉曼位移处的峰强度相对低,而在1003-1006cm^-1、1154-1159 cm^-1、1237 cm^-1和1518-1521 cm^-1的峰强度相对高。（4）PCA不能直接区分MRSA与MSSA。HCA、PLS-DA可区分两者。MRSA的不同组R1、R2、R3、R4相互之间也可区分。OPLS-DA分析MRSA与MSSA拉曼光谱的差异变量主要位于513-519 cm^-1、727-732 cm^-1、1147-1152 cm^-1、1513-1521 cm^-1。多变量统计分析模型的R²X（cum）为0.87,R²Y（cum）为0.712,Q²（cum）为0.73。（5）神经网络分类器对于MRSA和MSSA的判别分析受试者曲线下面积（area under the curve,AUC）值为0.986,精确率为0.960,召回率为0.959,初步选取神经网络为S.aureus临床耐药菌株的分类模型。机器学习方法筛选的MRSA和MSSA差异特征主要为721-727 cm^-1、697.821 cm^-1、960-972 cm^-1、1314.27 cm^-1、750-756 cm^-1、510.72 cm^-1,可与OPLS-DA分析的结果互补。研究结论:1.本研究系统性的评估了不同种类纳米材料用于病原菌无标记检测的SERS效应,筛选AgNPs⁺作为检测病原菌的增强材料,其增强因子达10⁷。建立并评价了基于AgNPs⁺的SERS检测方法,该研究方法可探测到单个细菌的拉曼信号。该检测方法的批内RSD为12.7%,批间RSD为14.31%。通过多变量统计分析病原菌的拉曼光谱,初步区分不同属、不同种、不同株的病原菌。进一步对临床菌株MRSA与MSSA的光谱数据进行区分,多变量统计分析模型的R²X（cum）为0.87,R²Y（cum）为0.712,Q²（cum）为0.73。通过机器学习方法,筛选神经网络作为MRSA与MSSA的分类器,预测模型的受试者曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）的AUC值为98.6%,对样本预测的符合率达95.9%,基于OPLS-DA与机器学习方法筛选了MRSA与MSSA的差异特征,两种方法筛选的结果可相互补充。2.本研究基于AgNPs⁺胶体溶液的SERS的检测方法,结合多变量统计分析和机器学习方法,一方面,有望为病原菌的快速鉴定和耐药性分析提供了新方法。另一方面,初步分析差异特征,为临床耐药菌株差异分子的归属、差异分子的生物学解释提供数据支持。