生命是物质运动的最高级形式,对生命及其组成部分的设计与人工改造有助于对其进行更好的理解和应用。合成生物学的主要目的就是利用工程化的方法和标准化、模块化的元件构建生命的各个层次：元件、装置、系统等,从而更好的理解生命并利用它们造福人类。然而目前可供利用的元件数量还比较少,而且现有的生物元件不能像电子元件等工程化的器件一样完美的工作：生物的开关不是完全的开关、外源的生物元件对宿主本身的干扰、生物元件之间复杂的相互作用、生物元件的组合往往不能符合预期等等。解决这些问题的一个方法就是对生物大分子进行人工的理性设计,以创造更多能更好的工作的生物元器件。然而目前对生物大分子单纯的理性设计成功率还非常有限；与此同时,定向进化也是一种有效的改造生物大分子的手段。本文从实验的角度研究了生物大分子的理性设计与定向进化的整合,综合使用这两种手段可以有效的构建更多更好用的生物元器件,从而构建更复杂、更大规模的生物体系,加强对生命的理解,更深远的意义是将有助于解决人类面对的能源、粮食、健康、环境等问题。DNA是遗传信息的载体,而蛋白质是生命活动的承担者。本文主要研究了蛋白质的设计与改造,当然这些是通过合成和改造DNA实现的。第一部分工作讨论了蛋白质的从头设计与人工改造。通过人工的观察对一个从头设计的蛋白质进行定点突变改造,15N-HSQC的实验结果证明这个蛋白质的结构得到了有效的改进。第二部分工作讨论了利用天然蛋白质模块组装设计新的蛋白质及其定向进化改造。六轮的迭代定向进化成功的改进了一个由天然蛋白质模块组装的新蛋白质。理化性质的鉴定结果表明,这个蛋白质的稳定性和可折叠性得到了明显的提升,尤其是其热稳定性提高了20℃以上。并且在进化过程中一个位置高频率突变为半胱氨酸从而形成分子内二硫键,实验的结果也证明这个二硫键对蛋白质的稳定性有明显贡献。第三部分工作讨论了人工设计相互作用蛋白质、蛋白质-蛋白质相互作用的实验鉴定及其定向进化。重新构建的基于小鼠DHFR(二氢叶酸还原酶)的PCA系统(蛋白质片段互补实验)具有很好的检测灵敏性,这套系统成功的对人工设计的蛋白质相互作用进行了鉴定和定向进化加强。另外,利用大肠杆菌的DHFR构建的PCA系统是高度可调节的,具有更宽的检测和应用范围。第四部分工作讨论了LacI(乳糖阻遏蛋白)这个特定蛋白质的特异性四聚筛选和低干扰生物元件的构建。基于本实验室已有的LacI突变体构建的转录逻辑门可以用于区分LacI的异四聚和同四聚。利用双筛选方法设计的两套基因线路可以用于一步筛选特异性四聚LacI,为了减小细胞间差异性,其中一套基因线路的报告基因部分还被整合到大肠杆菌的基因组中。第五部分工作讨论了构建人工基因线路来实现一定的功能。利用基于LacI突变体的转录逻辑门将群体感应系统和基因双稳态开关相组合,实现了细胞密度诱导的大肠杆菌分化,即相同基因型的大肠杆菌自主分化为不同表型。本文探讨了蛋白质从头设计、天然蛋白质模块组装的蛋白质设计、蛋白质-蛋白质相互作用的设计等理性的生物大分子设计与实验改造、定向进化筛选的整合。结合理性设计与定向进化改造的半理性设计是创造新的生物元件的有效手段,利用这些生物元件可以构建更可靠更复杂的生命各层次来实现特定的功能。比如,利用人工设计的转录逻辑门和其它生物元件构建的一套基因线路实现了大肠杆菌的分化,这初步尝试了人工设计和改造生物元件的应用。同时所构建的质粒均符合BioBrick标准,保留了进一步拓展的可能。为了构建更复杂更大规模的系统,本工作中也尝试了基因组的整合。很多的工作还需要进一步开展,希望这些工作最终能为人工设计和理解生命及其组成部分并将之应用于实际做出一份贡献。