纳米材料在生物医学领域得到了日益广泛的应用。其中,纳米气体发生器是一类新兴的纳米材料,能够在病灶部位产生NO,H2,H2S等治疗性气体,发挥调节功能,以达到理想的治疗效果。NO作为一种重要的气体信使分子,可以调节平滑肌放松、介导神经传递,还可以对抗病原体和肿瘤。可控释放NO的纳米气体发生器也在心血管疾病、伤口愈合、抗菌、肿瘤治疗等领域展现出巨大的应用前景。特别是NO作为增敏分子,通过协同作用可以提高其他肿瘤治疗手段的效率,增强疗效并降低毒副作用。基于蛋白质的NO纳米气体发生器无需外界刺激,通过与内源性底物反应,即可高效产生NO。然而,蛋白质的稳定性较差且不易保存和递送,这一瓶颈制约了其进一步应用。因此,构建新的高负载、高活性的蛋白质基的NO纳米气体发生器,用于肿瘤杀伤和协同治疗,可以为癌症治疗提供新的思路和方法。最近的研究表明NO可以调控内源性Ca2+的释放,而细胞内钙超载引发的细胞凋亡是一类新兴治疗方法——Ca2+干扰疗法的基础。基于以上研究现状,本论文围绕构建基于蛋白质的NO纳米气体发生器,通过NO对细胞内Ca2+水平的调控作用,实现Ca2+干扰疗法和NO气体治疗的协同作用展开。主要工作包括以下两个部分:1:基于ZIF-8的NO发生器的构建和细胞学效应探究本部分工作以ZIF-8为载体,载带葡萄糖氧化酶（GOx）和L-精氨酸（L-Arg）,制备了基于ZIF-8的单酶NO发生器（GOx-Arg@ZIF-8）,并通过SEM、DLS、Zeta电位、FT-IR、XRD等手段对得到的纳米气体发生器进行了表征。证明其粒径均一,稳定性好,蛋白负载率高,且保持了较好的酶活性。细胞学实验结果表明,GOx-Arg@ZIF-8能够被细胞有效摄取,通过消耗细胞内源性葡萄糖,引发级联反应,产生NO。此外,GOx-Arg@ZIF-8能够上调细胞内的ROS水平,从而增加细胞内的Ca2+水平。最后通过MTT法和Calcein-AM/PI双荧光染色法验证了GOx-Arg@ZIF-8对于肿瘤细胞的杀伤效果。本部分工作成果在于构建了一种NO纳米气体发生器,能够通过NO的氧化损伤效应杀伤肿瘤细胞,还确认了NO对于内源性钙离子水平的调控能力,为将NO治疗和Ca2+干扰疗法进行整合提供了依据。2:钙基双功能纳米气体发生器的构建和应用研究无定形磷酸钙（amorphous calcium phosphate,ACP）是近年来发现的磷酸钙的无定形中间相,已经被尝试应用为药物及核酸递送的载体。由于ACP的生物相容性良好、具有多孔结构,能够负载蛋白并保持其酶活性,并且能够响应酸性条件,发生降解而释放所载带的蛋白和Ca2+,因而被认为是具有潜力的蛋白纳米递送载体。本部分工作选择钙基材料ACP作为蛋白载体,构建了能够释放NO的纳米气体发生器,并考察了其产生NO和引发细胞内钙超载的效应。本部分工作分别构建了三种基于ACP的细胞内蛋白递送系统。首先,选择辣根过氧化物酶（HRP）,构建了单蛋白ACP运输平台（HRP-ACP）,实现较高的蛋白负载率（42%）,细胞实验证明其可以有效进入细胞并保存HRP的酶活性。显微成像实验观察到HRP-ACP定位到酸性溶酶体,并发生降解,释放出外源性Ca2+,提高了细胞内Ca2+浓度。接下来,选择具有级联关系的葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP）,构建了双蛋白纳米反应器（GOx/HRP-ACP）,该反应器可以在肿瘤细胞内产生.OH,杀伤肿瘤细胞。最后,利用GOx、HRP和NO供体羟基脲分子,共同构建了钙基双功能纳米气体发生器（GOx/HRP-HU-ACP）。该纳米气体发生器一方面能够在细胞内降解释放Ca2+,另一方面释放的酶能够消耗葡萄糖,引发级联反应,生成NO,产生的ROS和RNS对于肿瘤细胞有杀伤作用;此外,NO能够引发内源性Ca2+释放,与ACP降解产生的外源性Ca2+进行叠加,共同诱导细胞内钙超载,与NO引发的氧化损伤发生协同作用,在较低浓度下就能有效杀伤肿瘤细胞。本论文制备的钙基双功能纳米气体发生器创新性地将NO气体疗法与Ca2+干扰疗法联合起来,为新型纳米气体发生器的构建及协同抗肿瘤治疗提供了新思路。