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枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-903菌株是河南省农业科学院植物保护研究所从郑州果园中分离得到的生防菌株。经测定,它代谢产生的抗菌物质对多种植物病原真菌具有较强抑制作用。 本实验对枯草孢杆菌(Bacillus subtilis)B-903菌株所用培养基进行了优化,在所选用的培养基中,5号培养基:葡萄糖1.5%、淀粉0.2%、豆饼粉3%、硫酸锰0.1%、磷酸二氢钾0.15%、磷酸氢二钾0.3%、硫酸镁0.05%、酵母膏0.02%、氯化铁0.01%、碳酸钙0.01%效果较好。同时发现枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-903菌株的最佳发酵时间可以缩短。 该抗生素对植物病原菌的抑菌机理及其理化特性和发酵时间已有一些报道。但笔者在进行优化培养基的研究过程中发现,最佳发酵时间与前人的研究有所不同。在前人研究的基础上,通过摇瓶发酵(200ml/500ml、28℃、126r/min)筛选到种子液菌龄24h、摇瓶发酵72h的最佳发酵时间,比原来的种子液菌龄24h、发酵时间112h缩短40h,节约了能源和时间。 本研究以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-903菌株为出发菌株,对其进行亚硝基胍(NTG)和微波诱变处理,确定了两者诱变处理的最佳剂量:NTG最佳处理浓度为2001μg/mL,微波诱变选用850w、脉冲频率2450MHz处理100s,共筛选出13个高效突变株(其中NTG诱变数为7株,微波诱变数为6株)。经传代实验,2株高效突变株N1和W2抑菌圈直径分别稳定在26mm和24mm以上,比出发菌株提高21.8%和14.8%。 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B-903菌株通过摇瓶发酵培养所产抗生素经过灭菌、离心等预处理,然后用80%饱和度硫酸铵沉淀,脱盐后经活性炭脱色,茚三酮显色为淡紫色,初步确定为所产抗生素含有多肽或蛋白质或氨基酸。沉淀经80%乙醇提取、乙酸乙酯去杂质后浓硫酸显色为单点。过正相硅胶柱,用氯仿:甲醇(2:1)洗脱,未能将活性成分冲洗下来;过ODS-C18反相硅胶柱,用30%、50%、80%甲醇水溶液梯度洗脱,活性成分富集在80%甲醇洗脱液中。通过核磁共振波谱鉴定该活性成分为大分子量多肽。