布鲁氏菌可引起布鲁氏菌病,使大范围的哺乳动物致病,包括人类和家畜,每年约有500 000人受此病困扰,在很大程度上影响民生的需求,同时也在相当程度上影响畜牧业的发展,影响国际贸易及旅游事业,给人们带来巨大的经济损失。布鲁氏菌是典型胞内致病菌,与其它胞内寄生菌不同,布鲁氏菌不产生外毒素、无抗吞噬荚膜、无入侵酶、无LPS、无毒性质粒、无抗药性、不发生抗原变异,其主要的毒力是能侵入巨噬细胞并在其中增殖[1-5]。巨噬细胞作为免疫调节细胞和效应细胞,可消灭多数入侵的病原体,并激活宿主特异性和非特异性免疫应答。布鲁氏菌之所以能逃脱巨噬细胞的杀伤作用并在巨噬细胞内长期存活有以下策略:(1)迅速从吞噬溶酶体逃脱至细胞质中;(2)抑制吞噬溶酶体的形成;(3)抑制巨噬细胞分泌细胞因子;(4)抑制巨噬细胞的凋亡;(5)抑制巨噬细胞的抗原提呈能力[3-6]。所有这些策略都需要布鲁氏菌与巨噬细胞相互作用,巨噬细胞杀菌活性、抗原提呈能力及免疫调节能力被布鲁氏菌抑制的程度决定了布鲁氏菌能否继续在宿主细胞内存活和繁殖,因此,巨噬细胞早期的免疫应答反应对布鲁氏菌的存活和宿主免疫应答的产生起关键作用。然而,目前对巨噬细胞感染过程中的信号转导途径和布鲁氏菌的毒力策略知之甚少,为了揭示巨噬细胞的免疫监视防御机制和布鲁氏菌在细胞内的存活机制,解密布鲁氏菌-宿主相互作用的机制,本室利用二维电泳技术和质谱学相结合的方法,对布鲁氏菌侵袭宿主细胞后的蛋白表达谱进行鉴定,共确定了38个蛋白表达差异点,分别对应38个蛋白质编码基因。感染性疾病是病原微生物和宿主紧密作用的结果,研究感染过程中宿主的差异表达蛋白不仅有助于理解宿主反应的分子机制和病原微生物的致病机理,还有可能鉴定到新的分子标记物以及药物靶标,为此本研究结合国外的研究报道,选取其中两个可能对布鲁氏菌侵袭巨噬细胞发挥作用的差异表达蛋白-CIP29和WDR1进行研究以探讨其在布鲁氏菌感染巨噬细胞中的可能作用,为布鲁氏菌致病机制与巨噬细胞免疫防御机制研究奠定基础。目前对CIP29和WDR1的研究很少,生物信息学预测CIP29可能有核苷酸结合能力,参与重要的转录后和翻译后调控,参与新陈代谢,也可能是参与细胞凋亡调控的蛋白之一,在调节细胞命运的过程中可能起着非常复杂的作用。WDR1含9个WD重复结构域,可促进肌动蛋白的翻转,参与细胞形态的调节,参与蛋白-蛋白间的相互作用。布鲁氏菌侵袭THP-1细胞后,CIP29和WDR1的表达量发生明显改变,故本研究将干预细胞中CIP29和WDR1的表达,研究其对布鲁氏菌侵袭和巨噬细胞功能的影响,以揭示感染免疫过程中的关键事件,为布鲁氏菌的致病机制和巨噬细胞的防御机制研究奠定基础。本研究共分两部分:1、CIP29对布鲁氏菌侵袭的影响和其在巨噬细胞中功能的初步研究。(1)通过RT-PCR方法从细胞中获取CIP29基因片段;(2)构建重组质粒pET28a-CIP29,诱导表达并纯化重组蛋白CIP29,免疫动物制备多抗为下一步试验奠定基础;(3)构建重组质粒pEGFP-CIP29转染THP-1细胞上调CIP29在细胞中表达;(4)检测CIP29对细胞凋亡和分泌TNF-α能力的影响;(5)检测CIP29对布鲁氏菌侵袭THP-1细胞的影响。2、WDR1对布鲁氏菌侵袭和巨噬细胞功能的影响的初步研究。(1)通过RT-PCR方法从细胞中获取WDR1基因片段;(2)构建重组质粒pET28a-WDR1,诱导表达并纯化重组蛋白WDR1,免疫动物制备多抗为下一步检测siRNA干扰效果奠定基础;(3)设计合成siRNA序列,转染细胞,下调该蛋白在细胞中的表达;(4)检测WDR1对布鲁氏菌侵袭THP-1细胞的影响;(5)检测WDR1对巨噬细胞吞噬能力和TNF-α分泌能力的影响。结果:通过RT-PCR方法成功获得了CIP29和WDR1基因,并将其构建到表达载体上,制备了重组蛋白CIP29和WDR1以及各自的多克隆抗体;上调CIP29在细胞中的表达后可诱导THP-1细胞凋亡,与对照组差异显著;CIP29的高表达对TNF-α的分泌水平影响不明显,对布鲁氏菌侵袭细胞的过程略有影响,但无统计学差异。通过RNAi技术下调WDR1的表达后巨噬细胞吞噬能力发生明显改变,与对照组差异显著;WDR1的低表达对巨噬细胞分泌TNF-α的水平和布鲁氏菌侵袭细胞的过程无明显影响。结论:巨噬细胞防御布鲁氏菌的侵袭是多个蛋白共同协调作用的复杂过程,本文用干预的方法来研究这些差异表达蛋白的功能只是一种最简单初步的方法,由于各个蛋白的功能不同,要想确切了解其在布鲁氏菌感染中的作用,需综合多种技术手段。在本实验中,未观察到CIP29和WDR1在布鲁氏菌感染中的非常明确的作用,这是否是由于技术本身的局限性所造成,还是由于单一蛋白本身在调节布鲁氏菌感染过程中的复杂作用使其表现不明显,其作用还有待用其它的方法进一步验证。本试验结果初步说明单一蛋白对布鲁氏菌侵袭THP-1细胞的影响可能不显著,宿主防御布鲁氏菌的感染是多种蛋白,多层次协同作用的结果。