研究背景Wilson病（Wilson disease, WD）是少数可以治疗的神经遗传病之一。目前以青霉胺(Penicillamine, PCA)为代表的金属鳌合剂虽具有尿排铜量高、症状改善显著等优点，但其不良反应较多。锌剂等减少铜吸收的药物虽不良反应少，但排铜作用较弱，多用于症状前期患者或维持治疗。因此，WD的治疗亟待出现效果好、副作用少的WD治疗药物。四硫钼酸铵(Tetrathiomolybdate, TM)是一种铜离子的螯合剂，被吸收入血后与白蛋白和血铜形成一种无毒性的三集团复合物，竞争抑制肠粘膜对铜的吸收，从而可以有效促进铜排出，降低游离铜的浓度。目前已有TM治疗WD获得成功的报道，并发现其对肝脏和脑组织的损害有一定疗效。因目前该药尚在临床试验阶段，其具体疗效机制及不良反应尚未明确。铜负荷大鼠模型的肝、肾组织可产生类似于WD的铜沉积，且具有价格低廉、重复性好、易于获得等优点，是一种较好的研究WD病理病机和药物治疗学的动物模型。研究表明，肝损害是WD患者最常见的临床表现，而肝纤维化是其最常见的病理改变。目前发现P38、细胞外调节蛋白激酶(Extracellular regulated proteinkinase, ERK)、c-jun氨基末端激酶(C-jun N-terminal kinase, JNK)作为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)通路主要成员在肝纤维化的发生发展中发挥着重要作用。另有研究发现，过量的铜可引发神经细胞的自由基损伤、激活MAPK通路等多种细胞内蛋白质和酶类级联信号，调节核内转录因子和基因表达，引起细胞内钙超载，导致神经细胞变性、坏死，并在此基础上激活c-fos、c-jun、c-myc等基因的表达，诱发神经细胞凋亡。TM是否在螯合铜离子的基础上，通过调节MAPK等信号通路起到修复肝脏和脑组织损害的作用，目前尚未见相关报道。研究目的1.观察TM治疗铜负荷大鼠前后体内Cu、Zn、Fe、Mo等微量元素的改变，观察TM对铜负荷大鼠铜代谢的调节及对其他微量元素的影响，并探讨其可能的机制；2.观察TM治疗铜负荷大鼠前后行为学、血常规、肝肾功能等指标的改变，观察TM的疗效及其不良反应；3.观察TM治疗铜负荷大鼠前后肝、脑组织P38、ERK、JNK等蛋白表达水平，探讨P38、ERK、JNK等信号通路参与WD肝及脑损伤的作用机制，以及TM调节上述信号通路的肝、脑损伤保护机制，为TM治疗WD提供实验理论依据。研究方法1.将140只SD大鼠随机分为正常对照组、铜负荷模型组、TM组，PCA组和肝豆汤组等5组，选用PCA及肝豆汤作为阳性对照药物。通过喂食含硫酸铜1g/kg的饲料和0.185%的硫酸铜水的方法建立铜负荷大鼠模型。正常对照组的饲养环境与各治疗组相同，普通正常饲养，每日一次予生理盐水0.2ml/10g灌胃，连续4周；铜负荷模型组按0.2ml/10g每日一次予0.185%硫酸铜水灌胃及含硫酸铜1g/kg的饲料喂饲，连续4周；TM组按2mg/kg每日一次予TM灌胃给药，连续4周；PCA组按0.09g/kg每日一次予PCA灌胃给药，连续4周；中药组按0.2ml/10g每日一次予中药肝豆汤灌胃给药，连续4周，观察各组大鼠行为学等改变。2.通过等离子体原子发射光谱法及等离子体质谱法检测各组大鼠治疗前后血清、肝组织、脑组织Cu、Zn、Fe、Mo等微量元素的含量，分析Mo与Cu等微量元素之间的相关性；3.检测各组大鼠治疗前后血常规、肝肾功能，观察其差异，观察TM治疗铜负荷大鼠的疗效及不良反应；4.应用免疫组化-DAB染色法、Western-Blot法检测WD铜负荷大鼠模型治疗前后肝、脑组织P38、ERK、JNK等蛋白的表达水平，探讨TM对WD铜负荷大鼠模型上述通路的调节及对肝、脑损伤修复的机制。实验结果1TM对铜负荷大鼠铜相关微量元素代谢的影响1.1铜负荷大鼠体重、皮毛、精神状态等一般情况较正常组变差，经治疗后改善；1.2大鼠造模12周时血清铜含量较4、8、16周时明显增高（P＜0.05），最高达近2倍。1.3血清微量元素：TM组血清Cu较模型组明显减低（P<0.01），较PCA组、中药组无明显变化（P>0.05）；血清Zn较模型组增高（P<0.05）；血清Fe较PCA组明显减低（P<0.01）；模型组血清Mo含量较正常组、TM组明显减低（P<0.01）；TM组血清Se较正常组、模型组明显增高（P<0.01）；TM组血清Ni较正常组、模型组、中药组均增高（P<0.05）。1.4肝组织微量元素：TM组肝Cu含量较模型组显著降低（P<0.01），较PCA组、中药组略降低（P>0.05）；TM组肝Zn较其他各组无明显变化（P>0.05）；TM组肝Fe较其他各组均显著增高（P＜0.01）；TM组肝Mo含量较其他各组均显著增高(P＜0.01）；TM组肝Al较模型组明显减低(P＜0.01）；TM组肝I较其他各组均显著增高(P＜0.01）；TM组肝Pb含量较模型组明显降低(P＜0.01）；1.5脑组织微量元素：TM组Cu含量较中药组、模型组显著降低（P<0.05）；TM组Zn含量较其他各组均明显降低（P<0.05）；TM组Fe含量较模型组显著降低(P＜0.01）；TM组Al含量较模型组明显减低(P＜0.01）；TM组Pb含量较模型组及中药组明显降低(P＜0.01）。1.6TM组血常规、肝功能、肾功能均在正常值范围，较正常组无明显变化。2TM对铜负荷大鼠相关信号通路的影响2.1免疫组化法检测P38、ERK、JNK表达：各蛋白阳性表达为棕黄色，模型组及各治疗组均可见阳性细胞表达，模型组阳性表达较其他各组均显著增强（P<0.01），TM组肝组织各蛋白阳性表达较PCA组增强（P<0.05），但TM组脑组织各蛋白阳性表达较PCA组减弱（P<0.05）。JNK蛋白在脑组织未见明显阳性细胞表达。2.2Western-Blot法检测P38、ERK、JNK蛋白的表达：各蛋白水平在各组之间比较有显著差异，模型组各蛋白阳性表达量显著增强（P<0.01），TM组、PCA组、中药组与模型组比较，阳性蛋白相对表达量显著下降（P<0.01），TM组较PCA组阳性蛋白表达量有增高趋势（P>0.05）。JNK蛋白在脑组织未见特异性蛋白条带表达。结论1.铜负荷导致大鼠肝、脑组织中铜的过度蓄积，并可引起肝功能异常和行为学异常等肝和脑组织损伤的表现。2.铜负荷可诱导大鼠肝、脑组织中P38、ERK、JNK等信号通路的激活，引起肝、脑细胞损伤。3. TM有改善铜负荷大鼠肝功能和行为学的疗效，且无血常规、肝肾功能影响等不良反应。4．TM可以降低铜负荷大鼠血清、肝、脑组织Cu的含量(其驱铜效果较PCA无明显差异)，是其改善肝和脑组织损伤的主要原因。5. TM治疗铜负荷大鼠后血清中Mo与Cu、Zn、Fe等含量呈正相关，Mo可能通过与上述微量元素的拮抗作用参与肝细胞损伤及中枢神经细胞的损伤调节。6. TM能够下调铜负荷大鼠肝和脑组织中P38、ERK、JNK等蛋白的磷酸化水平，是改善肝和脑组织损伤的重要原因。