自噬（Autophagy）是当今生物科学领域中研究热点之一。自噬,是由溶酶体的发现者,比利时生物学家Christian-De Duve在1963年的一次溶酶体研讨会上正式提出的。自噬源于希腊文,译为self-eating即细胞内出现的自我吞噬现象。广义上的自噬是指大自噬或巨自噬,即从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹的细胞质或细胞器、蛋白等需要降解的成分共同构成的自噬体。自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体,实现细胞本身的新陈代谢需要和某些细胞器的更新。多项研究表明,自噬所降解的某些产物若得不到及时的有效的清理,或可引起某些神经退行性疾病,如帕金森病、阿尔茨海默症等。自噬在肿瘤代谢过程中也起到一定作用,但机理尚不明确。部分研究表明,在雄性生殖系统,自噬在损伤修复过程中也可以发挥作用。目前关于睾丸支持细胞自噬的研究主要集中于大鼠、小鼠等模式动物中,且多是离体的细胞培养实验,缺乏在体原位数据;在畜牧兽医领域中的经济动物,如山羊,睾丸支持细胞的自噬研究更是少有。本实验以山羊睾丸为研究对象,分为两个不同年龄段的试验组--成年组和幼龄组,成年组选用12月龄山羊睾丸,幼龄组选用2月龄山羊睾丸,以探究自噬在睾丸支持细胞中的作用。本实验利用透射电子显微镜对睾丸支持细胞中自噬的超微结构进行分析。通过免疫组化法,使用自噬相关蛋白ATG7判断试验组睾丸生精上皮内是否有自噬的发生;通过两组免疫荧光双标,Vimentin/p62,Vimentin/LC3标记精子发生过程中自噬在支持细胞内的分布位置。Vimentin标记支持细胞（SCs）,更好的显示SCs的形态;细胞自噬特异性蛋白LC3标记自噬体膜,p62锚定标记自噬体分解的内容物。本试验从细胞形态学角度揭示不同年龄的两个试验组睾丸内精子发生过程中SCs的形态、自噬的超微结构以及自噬在SCs的分布,为自噬可能参与睾丸内精子发生的局部调节提供依据。试验Ⅰ山羊睾丸支持细胞自噬在精子发生中的超微结构分析研究本试验采用透射电镜方法,观察山羊睾丸支持细胞在精子发生过程中的超微结构。成年组结果显示,SCs呈现不规则的长锥形,细胞核呈椭圆或类三角形,染色较淡,顶面有不同程度的放射状突起,侧面相邻细胞间镶嵌不同分化程度的各级生精细胞,精原细胞位于基底室内支持细胞底部。自噬体多分布于圆形的精子细胞附近。自噬小体（Autophagosome）在镜下多呈现双层或多层泡状结构,早期自噬小体源自内质网,内含有待分解的胞浆、蛋白成分以及破损的细胞器等。在精子细胞发育的高尔基期,圆形精细胞周围有微泡结构分布。在帽期,圆形精细胞进入伸长阶段形成顶体头部。随后的顶体期内,伴随逐渐形成的顶体周围,有大小数量不等的微泡结构,随着顶体的形成,自噬小体数量增加,最后与溶酶体结合形成自噬溶酶体,自噬溶酶体呈单层膜结构。在此过程中,自噬小体自基底面至近腔面呈逐渐增多的趋势。幼龄组结果显示,曲细精管管径较小,尚未完全成熟,观察到大量的精原细胞和初级精母细胞,并没有在电镜视野下观察到自噬小体和自噬溶酶体相关结构。试验Ⅱ山羊睾丸支持细胞自噬在精子发生中的免疫标记研究本试验应用免疫组化方法,用Atg7标记自噬相关蛋白,采用两组免疫荧光双标Vimentin/p62和Vimentin/LC3标记自噬在支持细胞内的分布。其中,Vimentin标记生精上皮中的支持细胞,细胞自噬特异性蛋白LC3标记自噬体膜,p62标记自噬所分解底物。免疫组化Atg7结果显示,幼龄组内无阳性。成年组睾丸的支持细胞内有棕褐色强阳性;免疫荧光双标结果显示,幼龄组呈Vimentin阳性/LC3阴性,Vimentin阳性/p62阴性,表明在幼龄组睾丸支持细胞中没有自噬的发生,与幼龄组免疫组化和透射电镜结果一致:成年组的Vimentin阳性,支持细胞内富含LC3阳性荧光亮点,LC3 阳性荧光亮点在基底面至近腔面均有分布且从基底面至近腔面有逐渐增多趋势。另外,Vimentin阳性支持细胞也表达p62阳性,有着广泛的共表达现象。以上结果与电镜结果一致,表明在成年山羊睾丸的精子发生过程中,支持细胞内发生了广泛的自噬现象。试验Ⅲ改进的免疫荧光染色方法对山羊睾丸染色效果的影响试验尝试使用改进的免疫荧光染色方法,在滴加抗体时,尽量扩大并完全覆盖组织;在适当的步骤添加自发荧光淬灭剂;在封片时使用抗荧光淬灭封片剂。改进方法与常规方法相比较,虽然相对耗时,但在图像采集时,可以使图像背景更加清晰,荧光淬灭时间更加长久,可以进行多次采集,减少试验次数,减少误差;试验结果显示,使用石蜡切片进行的免疫荧光染色,石蜡切片制作过程也不容忽视,切片质量的优劣会直接影响试验结果。