甘蔗ScCBLs和ScCIPKs基因家族的克隆与鉴定

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低温、干旱和盐碱是植物的生长过程中常见的非生物逆境。为了应对这些胁迫,植物在长期的进化过程中形成了一套自我保护的逆境信号传导和应答机制,其中包括细胞内第二信使——Ca2+信号介导的信号传递机制。钙调神经磷酸酶B类似蛋白(Calcineurin B-like protein, CBL)与下游钙调神经磷酸酶B类似蛋白互作蛋白激酶(CBL-interacting protein kinase, CIPK)相互作用,共同形成了植物应答逆境胁迫的CBL-CIPK信号系统。目前对于CBL-CIPK的研究主要集中在拟南芥和水稻上,在其他植物的研究也相应展开,但在甘蔗中研究甚少。因此,克隆甘蔗CBL-CIPK信号系统中的CBL和CIPK基因并进行初步的功能验证,对解析甘蔗抗逆机制具有较为重要的理论和实践意义。本研究在NCBI数据库和实验室前期转录组测序数据库中,查找和分析获得甘蔗ScCBL和ScCIPK基因相关的EST序列和Unigene序列;然后,利用电子克隆结合RT-PCR (Reversetranscription-PCR)技术,成功获得4个ScCBLs基因和10个ScCIPKs基因序列并对其进行了生物信息学分析;其次,利用实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)技术,分析这些基因在甘蔗中的组织特异性表达情况及其在不同外源胁迫下的表达特性;最后,通过双分子荧光互补技术研究了ScCBL2和ScCIPK 15蛋白之间的相互作用。主要研究结果如下:(1)通过电子克隆和RT-PCR扩增,从甘蔗中克隆获得4个ScCBLs和10个ScCIPKs家族基因。生物信息学分析显示,所获得的甘蔗ScCBLs蛋白都含有EF-hands结构域、Ca2+结合位点以及EFh superfamily结构域;ScCIPKs蛋白含有PKc.like superfamily和AMPKA.C-like superfamily,有一个CBL interaction结合位点和一个潜在的PP2C结合位点,这些结果与高粱、水稻同源的CBL和CIPK编码蛋白的氨基酸序列特征高度相似。系统进化分析结果显示,甘蔗CBL蛋白和CIPK蛋白与其他物种的CBL和CIPK蛋白都可以归类到各自的亚族中。(2)组织特异性表达的RT-qPCR分析显示,两个基因家族在甘蔗芽、髓、叶、分生组织和皮中均有表达,其中4个ScCBLs基因在分生组织、蔗芽和蔗髓中均有较高的表达;10个ScCIPKs基因中,ScCIPK4, ScCIPK15、和ScCIPK21在皮中有较高的表达量,ScCIPK5、ScCIPK110、ScCIP14在芽的表达量较高;仅有ScCIPK8在分生组织中有较高的表达量;ScCIPK9、ScCIPK17、ScCIPK28在叶中的表达量较高。(3)不同外源胁迫下基因表达的RT-qPCR分析表明,甘蔗中特定的ScCBL和ScCIPK对非生物胁迫外源因子ABA,盐(NaCl)胁迫、干旱(PEG)胁迫以及氯化钙(CaCl2)胁迫处理有不同的响应模式,且同一处理能够被不同的ScCBL和ScCIPK基因感应,说明不同甘蔗ScCBLs和ScCIPKs基因在应对非生物胁迫逆境中协同发挥作用,同时生物胁迫(接种花叶病毒)中,表现出了不同的表达水平。(4)双分子荧光互补杂交(BIFC)实验发现,甘蔗ScCBL2和ScCIPK 15蛋白之间相互作用,形成CBL-CIPK复合物来解码特异性的Ca2+信号,从而转导胁迫信号。
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