尼罗罗非鱼过氧化物体增殖激活受体(PPARα)激活及其降脂机制研究

来源 :华东师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wuhaoxin1987
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本研究采用营养学、生物化学、分子生物学及转录组学相关技术与方法,借助细胞培养、同位素示踪及活体注射等手段,较为系统地研究了尼罗罗非鱼过氧化物体增殖激活受体(PPARα)的结构、组织分布、激活机制及其对脂分解代谢的调控作用,较全面地分析了罗非鱼PPARα调控脂代谢的原理及主要靶点。本实验首先克隆了罗非鱼PPARα基因,分析了该基因的分子结构和功能。之后,利用PPARα的通用配体非诺贝特(Fenofibrate)和饥饿应激,在活体和细胞水平对罗非鱼PPARα的激活机制进行了确认,同时详细阐明了罗非鱼PPARα激活后对脂代谢的系统性调控机制。为探讨生理和营养背景是否会影响罗非鱼PPARα的激活和脂代谢调控效能,本文又通过对饲料脂肪含量的调节和长期投喂,首先构建高低体脂含量的罗非鱼模型,再在此生理和营养背景下添加PPARα配体Fenofibrtate饲喂4周,研究不同体脂和营养背景下罗非鱼PPARα的激活和降脂效能。最后,为进一步验证罗非鱼PPARα有效激活所需的营养学背景,并同时探索PPARα激活后的降脂效能是否能促进脂肪供能从而节约饲料蛋白,本文进一步采用不同蛋白脂肪水平配比饲料饲喂罗非鱼8周,研究了饲料蛋白脂肪配比对Fenofibrate激活罗非鱼PPARα调控脂代谢促生长效应的影响,以期了解罗非鱼PPARα激活促进脂肪分解提高饲料蛋白质利用效率的适宜饲料营养配比,为解决当前水产养殖中鱼类脂肪沉积过度提供理论依据。本文主要的研究结果和结论如下:1. PPARα的基因克隆和表达高等哺乳动物中,过氧化物体增殖激活受体α(PPARα)已被证实作为脂类分解代谢的关键调控因子并已得到广泛研究。然而,在鱼类中,PPARα影响调控脂代谢的情况及相关机制却仍不明了。为探究PPARα基因在尼罗罗非鱼脂肪分解代谢中的调控机制,本工作首先克隆得到了尼罗罗非鱼PPARα(NtPPARα)基因的全长序列,研究了NtPPARα基因的组织特异性表达,以期窥探相关的分子营养机制。结果表明,尼罗罗非鱼PPARa cDNA全长1686bp,包括167bp的5’端非翻译区(5’UTR),91bp的3’端非翻译区(3’UTR),开放阅读框(ORF)全长1428bp,编码475个氨基酸(GenBank accession No. AHI50297),预测分子量约为52.98 kDa,理论等电点为5.87。SWISS-MODEL模拟的PPARα三维结构显示该蛋白质有16个α螺旋和3条空间平行的p折叠,以及一些伸展片段和无规则卷曲等。作为核蛋白,其不存在信号肽,但含有典型的DBD和LBD结构域。与所比对的物种相比,PPARα氨基酸同源性均在63%以上,相似性中度同源,如与非洲爪蟾相似性63.7%,斑马鱼67.6%,小鼠64.5%,人64.7%。但在DBD结构域上,则显示出高度的同源性,如与非洲爪蟾相似性90.6%,斑马鱼90.6%,小鼠89.4%,人89.4%。不过值得注意的是在PPARα预测LBD结构域区,罗非鱼比同源的人和老鼠多出18个氨基酸(252-269),这一现象也发生在斑马鱼、草鱼和虹鳟上,分别多出6、2和2个氨基酸。由于LBD是PPARα激活必需的配基结合区,这一区域的氨基酸变异或许预示罗非鱼PPARα在激活机制上将与高等哺乳动物存在差异。进化树分析显示,NtPPARα与金头鲷亲缘关系最近,而与人最远。组织特异性表达研究表明,罗非鱼PPARα基因在脑、心、肝脏中表达最高,红肌、肾、皮肤、脂肪组织、鳃和白肌次之,在脾脏中表达最低。这与高等动物上PPARα主要分布在脂肪酸分解代谢较强的肝脏、心、脑、骨骼肌等相一致。2.罗非鱼PPARα激活机制及激活后对脂代谢的系统性调控功能为验证PPARα在罗非鱼细胞水平和活体水平上的激活机制,本部分工作采用PPARα通用配体Fenofibrate对罗非鱼肝脏原代细胞和活体进行分别处理,研究其对罗非鱼PPARα的激活情况,并随后进一步研究罗非鱼PPARα被激活后对脂代谢的系统性调控机制。本实验首先将密度为106ml-16孔板肝原代细胞培养12h贴壁后,在细胞培养液中添加200nM Fenofibrate或进行血清饥饿处理,然后在12h和24h分别对细胞采样,以测定细胞PPARα在mRNA、蛋白和蛋白磷酸化水平上的表达变化。结果显示:两种处理12h后PPARα在各水平上均无显著变化,但在Fenofibrate处理24h后,PPARa的mRNA表达水平显著升高。此外,在两处理作用24h后,PPARa蛋白表达水平显著增加,同时蛋白去磷酸化水平也有显著增加。为此我们可首先推断鱼类PPARa可像哺乳动物一样被激活,但不同激活方式、激活时间会在mRNA、蛋白和蛋白磷酸化水平上存在激活效应的差异。在活体实验中,我们对初始体重为11.83±0.11 g的鱼进行高脂饲喂、高脂饲喂+fenofibrate、4周饥饿三种处理,养殖4周,以期通过外源性药物和自然饥饿降脂两种方式来研究罗非鱼PPARα在活体状态下的激活和激活后的脂代谢调控机制。结果显示:4周后,Fenofibrate和饥饿处理对罗非鱼均呈现明显的降肝脏脂效应,饥饿处理下降脂效果最为明显。Fenofibrate处理下,PPARα在mRNA和蛋白水平均没有明显变化,但是PPARα蛋白磷酸化呈现显著降低。而在饥饿处理下,PPARα在mRNA、蛋白和蛋白去磷酸化水平均有明显的上调效应。同时,通过罗非鱼活体注射标记脂肪酸后的分解率测定、线粒体和过氧化物酶体脂肪酸β-氧化分解率测定和线粒体数目的测定,我们也发现PPARα激活后的降肝脏脂肪作用主要是通过对线粒体脂肪酸β-氧化分解率的提升和线粒体数目的增加来实现的。此外,PPARα的激活也可促进糖异生作用的增强。综上所述,本工作表明:1) PPARα在蛋白层面的去磷酸化修饰是罗非鱼PPARα激活的基本机制,只有当激活效应足够强时,才能通过上调PPARα的转录水平和蛋白表达水平作为进一步的补充机制;2)罗非鱼PPARα激活后的靶标调控组织是肝脏,且调控活性较弱,低于啮齿类动物;3)PPARα激活降脂的代谢调控主要是通过线粒体数量增殖、提升线粒体脂肪酸p-氧化效率来实现4)PPARα激活后会引起能量代谢通路的系统性变化,尤其影响糖代谢,使糖异生活性增加。这一工作也是国际上对鱼类PPARα激活和代谢调控机制的首次阐述。3.罗非鱼不同体脂和饲料脂肪水平对Fenofibrate所诱导的PPARa激活及脂代谢调控活性的影响在前一部分工作获知了罗非鱼PPARa的激活机制和对脂代谢的基本调控活性后,本部分工作通过两个阶段的实验,进一步探讨PPARa的激活和对脂代谢的调控活性是否也受到鱼体自身体脂含量和饲料脂肪含量的影响。本部分工作首先构建了高低体脂含量的罗非鱼模型,之后再进行Fenofibrate诱导实验。在第一阶段的实验中,对初始体重为2.24±0.04 g的罗非鱼分别饲喂酪蛋白和明胶为主要蛋白源,豆油为脂肪源的纯化饲料,配制成蛋白水平43%,脂肪水平分别为1%和13%的两组高低脂肪饲料,进行10周养殖实验。从本实验结果可知,高脂饲料投喂下罗非鱼增重率(WGR)和肝体比(HSI),以及肌肉、肝脏和脂肪组织中的甘油三酯均无显著变化,但是高脂饲喂组其脂体比(MFI)和脂肪组织重量显著高于低脂饲料组,形成两组体脂含量显著不同的实验鱼。血清生化指标显示,两饲料组除高脂肪组丙二醛(MDA)显著升高外,其它检测指标差异均不显著。荧光定量结果显示,高脂投喂水平下,脂肪组织脂肪水解相关基因甘油三酯脂肪酶(ATGL)和激素敏感脂肪酶(HSL)与脂肪合成相关基因类固醇合成元件结合蛋白(SREBP1c)均极髭著高于低脂饲喂,而其它所有检测组织FABP4均显著下调,肝脏炎症相关基因TGF1β显著上调。尤其重要的是,这一阶段的结果表明,单纯的高脂饲料投喂并不能上调PPARα和其调控的脂分解基因的表达。为研究不同体脂沉积背景结合饲料脂肪水平对Fenofibrate激活PPARα降脂效应的影响,第二阶段的实验采用前一阶段所得不同体脂含量的罗非鱼为研究对象,采用在原饲料基础上分别添加与不添加Fenofibrate的处理,进行为期4周的养殖。结果显示,高低饲料脂肪饲喂背景下,罗非鱼增重率(WGR)和脂体比(MFI)以及肌肉、脂肪组织中的甘油三酯均无显著变化,但是高脂肪饲料饲喂组其肝体比(HSI)和甘油三酯(TG)水平显著降低。血清生化指标显示,两饲料组除高脂肪组甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)显著降低与高密度脂蛋白(HDL)显著升高外,其它指标两处理组间差异均不显著。体外β-氧化和线粒体标志酶MAO测定实验显示,高低脂饲料饲喂组的肝脏氧化分解率与酶活性均显著升高,而肌肉和脂肪组织影响不大。而mRNA表达和蛋白印迹测定结果显示,药物处理后,肝脏PPARα mRNA和蛋白水平均在高脂肪饲料饲喂组显著升高,但在低脂饲料组无显著差异。其它脂代谢相关基因的检测显示,在高脂饲料投喂下,Fenofibrate处理会促发FABP4显著上调,TGF1β显著下调,肌肉组织CPT1α和CPTlb均显著上调,脂肪组织影响不大;而在低脂饲料组,Fenofibrate处理则使得肌肉PPARα的表达反而显著下调,脂肪组织ATGL显著上调,而肝脏无影响。综上所述,本研究表明:1)单纯的高脂摄入不能激活罗非鱼的组织PPARa表达;2)高脂饲料饲喂状态下,罗非鱼呈现一定程度的炎症与脂质过氧化反应;3)Fenofibrate激活罗非鱼PPARa调控降脂与营养背景密切相关,其对脂肪分解代谢的调控作用在高脂摄入状态下更为明显;4)肝脏是PPARa调控主要靶组织;5) Fenofibrate处理可以有效降低高脂饲料投喂下罗非鱼的肝脏脂含量,并可能同时存在对炎症的缓解效应。4.饲料中不同蛋白/脂肪配比对Fenofibrate所诱导的罗非鱼PPARa激活及脂代谢调控活性的影响在了解饲料脂肪水平可以影响Fenofibrate所诱导的PPARa激活及脂代谢调控活性后,为更全面地探讨其它营养因素对罗非鱼PPARa激活及脂代谢调控活性的影响,并验证PPARa激活所导致的降脂效果是否可以起到节约饲料蛋白质并促进生长的作用,本实验重点探讨了在不同蛋白/脂肪配比情况下,Fenofibrate所诱导的罗非鱼PPARa激活及其对脂代谢调控活性的差异。本实验以丹麦白鱼粉、大豆粉为主要蛋白源,设二蛋白水平28%和38%(低蛋白和高蛋白);豆油(SO)、鱼油(FO)为主要脂肪源,设二脂肪水平7%和14%(中脂肪和高脂肪),共配制成4种基础饲料。同时,通过在基础饲料上添加或不添加Fenofibrate,从而配制成4组加药饲料(Fenofibrate)和4组不加药的对照饲料。本实验使用480尾初始体重为8.0±0.10 g的罗非鱼,随机均分至24个桶连成的循环系统,每组饲料设3个平行,进行为期8周的养殖实验。结果表明,各饲料组的水分和蛋白含量均没有显著差异。28%饲料蛋白水平下药物组的增重率、蛋白质效率显著低于对照组,而饵料系数、肝体比要显著高于对照组。药物处理降低了所有组血清中的低密度脂蛋白(LDL),所有高脂肪水平组的高密度脂蛋白(HDL),以及低蛋白中脂肪水平组的血清总氨基酸(AA)和血氨(NH4),但低蛋白中脂肪水平组的血清甘油三酯(TG)和丙二醛(MDA)水平在药物后有显著升高。药物处理后,高蛋白中脂肪组脂肪分解与合成相关基因分别呈现显著上调(CPT1a、ALCY、FAS、 GPAT)和下调(ACO、DGAT2),脂蛋白相关基因呈现显著下调(LDLR、MTP、 ApoB),其余各组基因相对变化较小。以上实验结果表明,1)在以鱼粉、豆粕为主要蛋白源的半纯化饲料中,使用Fenofibrate作为降脂激活剂所起到的明显的降肝脏脂肪效应与饲料蛋白含量呈正相关,高饲料蛋白下Fenofibrate的降脂效果更为明显;2) Fenofibrate在高蛋白中脂肪水平有一定的降脂促生长趋势外,其余均没有明显的起到降脂促进罗非鱼生长的效应。相反,药物处理还抑制了低蛋白组罗非鱼的生长,并在低蛋白中脂肪水平导致肝脏代谢功能受损和并产生过氧化应激。综上所述,Fenofibrate所诱导的罗非鱼PPARα激活及其脂代谢调控活性与饲料蛋白水平和蛋白脂肪配比密切相关。
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