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目的:已有国外文献及我科前期实验证明,CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory T cell, Tr)是一种免疫抑制性调节细胞,可以抑制机体识别自身肿瘤细胞的肿瘤效应细胞的发育和活化,在介导肿瘤免疫耐受与肿瘤免疫逃逸中起重要作用,在初治非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)患者外周血中CD4+CD25+Tr细胞比例明显升高,初治患者CD4+CD25+ Tr细胞比例较正常对照组CD4+CD25+Tr细胞比例明显升高,化疗后完全缓解者(CR)及部分缓解者(PR)CD4+CD25+ Tr细胞比例与治疗前均有显著性差异。且初治NHL患者外周血CD4+CD25+ Tr细胞比例与患者年龄、性别、PS状态、临床分期、病理类型之间未发现明显相关性。通过上面的结果,可以认为,CD4+CD25+ Tr细胞比例是一个较好的反映细胞免疫功能状态的参考指标之一。如能阻断CD4+CD25+ Tr细胞活化、增殖的途径,将打破机体对肿瘤细胞的耐受,从而引起机体对肿瘤细胞的免疫作用,清除肿瘤细胞。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocytic associated antigen,CTLA-4)是活化T细胞表面表达的一种跨膜糖蛋白分子,与B7和CD28同属免疫球蛋白超家族成员。现代免疫学研究发现,初始T细胞的完全激活需要双重信号的刺激,既需要T细胞上抗原受体(TCR)提供的抗原特异性信号,即T细胞上TCR和APC加工处理的抗原肽-MHC复合物结合(第一信号),还必需有抗原非特异性共刺激(COSTIMULATION)信号(第二信号),若缺乏第二信号的辅助,将使T细胞处于克隆无能(anergy)状态。虽然CTLA-4在活化T细胞膜上的表达量仅为CD28的1/30～1/50,但它与B7的亲和力是CD28与B7的20倍以上,是T细胞活化中重要的调节分子。CTLA-4单克隆抗体可以阻断CTLA-4与T细胞的结合位点,从而阻断T细胞的活化、增殖,进一步抑制CD4+CD25+ Tr细胞的激活,使CD4+CD25+ Tr细胞在抑制机体对肿瘤细胞免疫作用减弱,近年来,CTLA-4单克隆抗体作为一种有效的治疗手段显示了其广阔的应用前景。CTLA-4单克隆抗体已在多种自身免疫性疾病、移植抗排斥、基因治疗上进行广泛的临床应用研究,但在恶性肿瘤,尤其是血液系统恶性肿瘤中的应用还罕有研究。通过上面CTLA-4单克隆抗体作用机制的阐述,我们可以预测CTLA-4单克隆抗体在血液系统恶性疾病,尤其是恶性淋巴瘤的治疗上会有广阔的应用。本试验通过CTLA-4单克隆抗体在荷淋巴瘤裸鼠体内阻断CD4+CD25+ Tr细胞的活化、增殖,从而打破机体对肿瘤细胞的耐受,抑制肿瘤细胞生长。从而验证CTLA-4单克隆抗体对淋巴瘤的作用。同时探讨CTLA-4单克隆抗体在淋巴瘤细胞增殖、凋亡中的作用及其可能的机制,为淋巴瘤的靶向治疗提供新的思路。方法:1人淋巴瘤Jurkat细胞株的培养和传代人T细胞淋巴瘤Jurkat细胞用含10%新生小牛血清的RPMI1640培养液培养,置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中,2—3d换液传代。2荷人淋巴瘤Jurkat细胞裸鼠模型的建立5周龄左右的Balb/c裸鼠,4 Gy照射,3 d后于右腋皮下接种Jurkat细胞每只0.2mL(每1mL含3×107个Jurkat细胞)。待瘤块长至一定大小后,处死荷瘤裸鼠。无菌条件下将瘤块分割成2—3mm的均匀小块,注入10只5周龄左右的Balb/c裸鼠头背部皮下。10 d以后,发现瘤块长势良好。随机分为2组,分别为实验组与空白组,每组5只,在肿瘤体积长至100 mm3左右时开始给药。3腹腔给药将CTLA-4单克隆抗体稀释为(2g/L),每只裸鼠腹腔内注射0.2ml(约0.4mg),共两天。4实际测量给药后肿瘤生长情况用药后测量肿瘤体积,每周2次,共4周。5处死裸鼠用药后4周,处死所有裸鼠,剖取肿瘤组织,将每只裸鼠的肿瘤组织分为5部分。并取血约1mL加入EDTA-K2抗凝。6 HE染色光镜下观察用药前后肿瘤组织形态变化取肿瘤组织固定、脱水、浸蜡,制备成石蜡块。切片,HE染色、封片,显微镜下观察实验组与空白组肿瘤组织形态。7免疫组织化学观察用药后肿瘤组织CD4+、CD8+T细胞浸润情况取裸鼠肿瘤组织,固定、石蜡包埋、切片,SP法染色。参照试剂说明进行阳性结果判定,PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照,以细胞内出现棕黄色为阳性细胞。每张组织切片随机观察5个高倍视野(×200),每高倍视野计数200个细胞,以阳性细胞百分比为计数结果。8流式细胞术(FCM)检测用药前后裸鼠外周血中CD4+CD25+Tr细胞的变化取EDTA-K2抗凝血0.1ml,分别加入CD4、CD25抗体各20μL,室温下孵育30分钟,加入红细胞裂解液,用破膜剂及固定剂处理红细胞,然后上机检测。应用Expo 32 ADC进行免疫荧光数据分析,用Muticycle AV分析对DNA细胞周期拟合分析。9半定量RT-PCR技术检测Jurkat细胞β-catenin、survivin、c-myc和cyclinD1 mRNA表达提取每只裸鼠肿瘤细胞总RNA,鉴定RNA纯度,检测RNA完整性,引物设计,所有RT-PCR引物均由上海生物工程公司合成,细胞总RNA预温后,加入逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)(二步法)反应体系进行反转录,得到cDNA。再进行PCR扩增,取扩增产物,加样于琼脂糖凝胶加样孔中,电泳30 min,用凝胶成像系统分析并拍摄图象,采用Gel-Pro Analyzer 3.1分析软件分析条带光亮度,对其进行半定量分析实验,计算相对系数。10流式细胞术(FCM)检测肿瘤细胞周期的变化及凋亡将裸鼠肿瘤组织制备为单细胞悬液上流式细胞仪检测肿瘤细胞周期变化及凋亡。11统计软件SPSS13.0对数据进行统计分析结果:1 CTLA-4单克隆抗体抑制人淋巴瘤Jurkat细胞在裸鼠体内增殖,在一定剂量下呈时间依赖关系。随着药物作用时间的延长,肿瘤细胞体积较空白组增长缓慢。可绘为时间、体积曲线图。2光镜下空白组裸鼠肿瘤细胞呈弥漫浸润,瘤细胞为中等大小,核圆形或不规则圆形,核膜清楚,核分裂象易见,实验组肿瘤细胞较空白组浸润程度低,中等大小,核多为圆形,核膜清楚,核分裂相较少。3 CTLA-4单克隆抗体可降低裸鼠肿瘤组织中CD4+及CD8+T细胞的比例。免疫组化分析结果显示空白组CD4+T细胞浸润比例为(57.5±1.3%),CD8+T细胞浸润比例为(31.7±1.1%),实验组CD4+T细胞比例为(25.3±0.9%),CD8+T细胞比例为(18.4±0.7%),两组有显著差异(P<0.05)。4 CTLA-4单克隆抗体可降低裸鼠外周血中CD4+CD25+Tr细胞的比例。空白组CD4+CD25+Tr细胞的比例为(6.26±3.95)%,实验组CD4+CD25+Tr细胞的比例为(1.96±0.92)%,空白组与实验组有显著差异(P<0.05)。5 RT-PCR检测结果显示,人淋巴瘤Jurkat细胞可扩增出特异性条带,与拟扩增分子片段大小相符。经CTLA-4单克隆抗体处理4周后,人淋巴瘤Jurkat细胞β-catenin mRNA表达水平并没有明显变化,与空白组相比没有统计学意义(P>0.05)。而β-catenin/TCF下游靶基因c-myc、cyclinD1和survivin mRNA表达水平却降低了,与空白组相比差异具有统计学意义(P<0.01)。6流式细胞术检测结果显示,CTLA-4单克隆抗体处理后,Jurkat细胞出现亚二倍体凋亡峰,且细胞凋亡率明显增加,CTLA-4单克隆抗体作用4周的细胞凋亡率(15.52%)明显高于空白组细胞的凋亡率(3.46%);CTLA-4单克隆抗体作用后G0/G1期细胞(28.73%)较空白组(17.54%)明显增加,S期细胞明显减少,两组间差异有显著性(P<0.05),CTLA-4单克隆抗体能使细胞停滞在G0/G1期。结论:1在一定剂量下,CTLA-4单克隆抗体减缓人淋巴瘤Jurkat细胞在裸鼠体内增殖,呈时间依赖关系。2 CTLA-4单克隆抗体可使肿瘤细胞在裸鼠体内浸润程度减低。3经CTLA-4单克隆抗体处理后,裸鼠肿瘤组织中CD4+T细胞及CD8+T细胞浸润比例减低。4 CTLA-4单克隆抗体可降低裸鼠外周血中CD4+CD25+Tr细胞的比例。5经CTLA-4单克隆抗体处理后,c-myc、cyclinD1和survivin mRNA表达水平降低。6 CTLA-4单克隆抗体能使肿瘤细胞停滞在G0/G1期,并使肿瘤细胞凋亡率增加。