研究背景:以奥氮平(Olanzapine,Olan)为代表的二代抗精神病药物(Second-generation antipsychotic drugs,SGAs)长期使用容易导致患者体重增加、肥胖和其他代谢性疾病,如高脂血症、II型糖尿病。研究发现,SGAs诱发的脂代谢紊乱治疗控制不理想、且缺乏相应的预防措施致使心脑血管并发症和早逝风险大为增加。此类药物作用外周组织介导脂代谢紊乱的信号通路研究受到国内外同行专家的高度关注,其研究多集中在细胞水平(如3T3-L1脂肪细胞、Hep G2肝癌细胞、以及一些原代细胞)。然而,整体水平上进行药物代谢性副作用的观察,尤其针对特定作用靶点进行药物干预的研究鲜有报道。倍他司汀(betahistine)是临床上已有的组胺H1受体(histamine H1 receptor,H1R)激动剂、H3受体(histamine H3 receptor,H3R)拮抗剂。研究发现,倍他司汀直接激活大鼠下丘脑中H1R,降低Olan对该受体的拮抗效应,从而减少了食物的摄取和体重的异常增加。肥胖往往是血脂紊乱的外在表现,那么,对体重有良好控制作用的倍他司汀是否能较好地调节Olan引起的脂代谢紊乱呢?而其中的干预机制未见报道。肝脏是SGAs引起脂代谢紊乱的主要外周组织,而其中各项脂代谢观察指标处于动态变化中。为了正确诠释这些变化的真正意义,本课题欲模拟Olan临床口服给药方式和推荐剂量,诱导大鼠产生脂代谢紊乱,在此基础上,研究该药物对肝脏中两个脂肪代谢转录调控因子甾醇调节因子结合蛋白(sterol regulatory element binding proteins,SREBPs)、过氧化物酶体增殖激活受体(peroxisome proliferator activated receptorsα,PPARα)以及它们下游基因转录和表达的影响,进一步观察肝脏上H1R等受体和能量调节关键分子AMP依赖蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)因Olan多用后的变化。通过以上研究,探明Olan介导脂代谢紊乱的潜在机制,同时,评价临床已有药物倍他司汀干预脂代谢紊乱的疗效,进一步揭示其干预治疗的分子机制。研究方法:实验一模拟Olan临床口服给药方式和推荐剂量,由多剂量比较实验,诱导大鼠产生脂代谢紊乱,并确定脂代谢紊乱机制研究中的最佳药物剂量:选择体重为180-220 g成年Sprague Dawley(SD)大鼠,通过主动口服方式,分别给予0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/kg体重的Olan(t.i.d.),连续2周,期间检测大鼠体重、摄食、饮水变化。药物处理2周后,检测血清TG、TC、HDL、LDL以及空腹血糖值。实验二单剂量口服Olan药代动力学研究:为了明确给药次数以及动物处理及采样时间点,在实验一多剂量Olan诱导脂代谢紊乱的比较实验后,本章节通过药代动力学研究方法,进一步明确1 mg/kg Olan口服给药后,药物在大鼠体内血药浓度达峰时间、峰值、药物消除半衰期。实验三Olan对SREBP调控的脂肪代谢相关基因m RNA表达的急性影响及不同组织间的差异:为了尽量减少代谢产物(如TG、TC)引起的反馈调节效应以及肥胖对代谢的影响,在Olan(1 mg/kg)单次口服给药后6 h,即血药浓度达到峰值和12 h,此时血药浓度已降至峰值的25%时,检测肝脏及白色脂肪组织中(肾周垫)SREBP调控的脂肪代谢相关基因进行了转录变化。实验四基于临床用药情况,考察Olan和倍他司汀介入治疗对血脂浓度及SREBP-1和PPARα依赖的脂肪代谢调控通路的影响:1 mg/kg体重的Olan(t.i.d.)长期且反复处理大鼠,届时倍他司汀(9.6 mg/kg,t.i.d.)介入治疗,考察血液及肝脏中脂质浓度的变化;利用荧光定量RT-PCR以及Western blot对SREBP-1和PPARα依赖的脂肪代谢调控通路中相关基因及蛋白的表达进行分析。实验五肝脏组胺H1受体及AMPKα在倍他司汀逆转Olan引起的血脂异常中的作用探索:基于中枢神经中的变化,利用荧光定量RT-PCR以及Western blot检测肝脏上组胺H1受体和AMPKα表达量及后者磷酸化水平。研究结果:①模拟Olan临床口服给药方式,成功诱导了大鼠脂代谢紊乱。结果显示,1.0及2.0 mg/kg剂量组的大鼠,体重、白色脂肪总量、TG、TC的浓度均显著高于对照组,而低剂量组与对照组无显著性差异。4.0 mgk/kg最高剂量组的大鼠,食物摄入量、血清中TC浓度以及空腹血糖浓度与对照组相比均有显著性增加,尤其空腹血糖浓度在所有剂量组中升幅最大,但这一组动物体重、白色脂肪总量以及TG的增加并不显著。在参考以往脂代谢紊乱大鼠模型指标的基础上,我们认为1.0及2.0mg/kg两个浓度的Olan经口服给药能引起大鼠显著的脂代谢紊乱,并且这两个药物浓度及其口服给药方式可以作为之后研究Olan脂代谢紊乱机制时的动物模型构建方法。②通过大鼠单剂量口服Olan的药代动力学,发现大鼠服药后6 h,血药浓度达到最大值——276.5 ng/m L,药物消除半衰期为3.5 h,由此确定了1 mg/kg Olan长期作用时,一天三次的给药次数以及药物急性效应研究中6 h和12 h的两个采样时间点。③Olan急性效应实验发现在白色脂肪组织和肝脏中,Olan对SREBPs及其调控基因的转录表达有着直接的激活作用。药物处理后6 h,srebp-1c和下游靶基因acc1、fasn,以及srebp-2和它调控的hmgcs、hmgcr、ldlr基因表达均显著增强。本实验中,单剂量口服Olan处理动物6 h和12 h,未能引起血清中TC,TG,HDL-C,LDL-C浓度的显著变化,因此,我们认为药物处理后各时间点所有基因表达的变化均是药物直接效应而非产物引起的负反馈调节结果。此外,Olan对脂肪酸和胆固醇合成基因的刺激作用表现出不同的变化模式。SREBP-2控制的胆固醇合成基因在血药浓度达到峰值时其表达被显著增强;当血药浓度下降后,最初上调的表达显著回落至基点。相反,SREBP-1及其调控的脂肪酸合成基因(fasn、acc1)却因为药物的作用,m RNA的表达持续升高,即使在血药浓度降低后(12 h)。④Olan长期作用引起了大鼠体重和血清NEFA(游离脂肪酸,non-esterified fatty acid)、TG以及肝脏组织中油脂的显著增加,却没有引起TC的明显改变。倍他司汀介入有效地改善了Olan引起的血脂紊乱。分子检测发现,单独Olan处理导致了Srebp-1及其下游的脂肪酸合成关键基因(Acc1,Fasn,Scd1)转录水平显著上调(p<0.01)。其中,Scd-1基因表达增加到5.18±0.56倍(p<0.01)。与Olan实验组相比,联合给药组中这些基因的表达被显著抑制。蛋白检测发现,虽然胞浆中SREBP-1前体蛋白(precursor form SREBP-1,p-SREBP-1)浓度并无显著变化,但核内活性形式的SREBP-1含量则因Olan的作用显著增加(p<0.05)。Olan也因此增加了SREBP-1蛋白的活化率(the ratio of m-SREBP-1 over p-SREBP-1 protein levels)。重要的是,单独使用倍他司汀以及联合给药组的动物,肝脏中m-SREBP-1浓度较Olan组均出现了显著地下降(p<0.05),并且血清TG浓度与核内m-SREBP-1蛋白含量呈显著的正相关(r=0.459,p=0.012)。此外,Olan长期作用后显著地降低了CPT1A蛋白含量(p<0.05),而单独使用倍他司汀以及联合给药组的动物,肝脏中PPARα的转录水平(p<0.01)和蛋白水平(p<0.05)均被显著增加。而且,肝脏中TG的含量与PPARα蛋白浓度表现出显著的负相关(r=-0.316,p=0.039)。而它下游的靶分子CPT1A,在倍他司汀和联合药物作用和都表现出转录水平的增加(p<0.05)。⑤Olan长期作用使肝脏上H1R受体浓度显著增加了~67%,这种变化趋势与核内m-SREBP-1蛋白的浓度呈显著正相关(r=0.343,p=0.05)。在倍他司汀联合给药组中,H1R受体的浓度下降到对照组的~76%(p<0.01)。其中,H1R受体浓度与血浆中NEFA浓度表现出非常显著的负相关(r=-0.502,p=0.005),与肝脏中AMPKα的磷酸化水平也存在着非常显著的负相关(r=-0.772,p<0.001)。但是其余三个受体除M3R的浓度因Olan作用有显著增加外(p<0.05),其余各受体并未因药物作用出现显著性变化。对于肝脏AMPKα的检测,Olan并未引起该分子及其磷酸化水平的显著性变化,但倍他司汀却引起了磷酸化AMPKα(p AMPKα)分子表达的显著增强,且p AMPKα/AMPKα值也显著增加(p<0.05)。AMPKα下游分子ACC1,其磷酸化蛋白浓度因倍他司汀单独以及联合处理分别比对照组增加了~54%和~47%的浓度(p<0.05)。ACC1因倍他司汀作用减少至对照组的~63%(p<0.05),与之相反的是,Olan作用则促了ACC1分子表达(p<0.01)。整个过程中,ACC1蛋白浓度与m-SREBP-1分子浓度有着显著地正相关性(r=0.603,p=0.004),而与p AMPKα浓度呈现显著负相关(r=-0.387,p=0.009)。此外,分析p AMPKα时发现,该分子表达水平与CPT1A蛋白浓度有着非常显著的正相关性(r=0.849,p<0.001)。结论:本课题模拟Olan临床口服给药方式和推荐剂量(1 mg/kg),成功诱导了大鼠脂代谢紊乱,并在此基础上,初步探明了Olan引起脂代谢紊乱的药理机制:①Olan直接作用肝脏和脂肪组织中SREBP调控的脂肪代谢通路,并增强p-SREBP-1的翻译后剪切激活作用,促进脂肪合成基因表达;②Olan下调CPT1A基因的转录和蛋白表达,使脂肪合成增加,分解下降,最终导致血脂升高。鉴于脂代谢紊乱的严重性,基于外周组织脂代谢紊乱调控机制,首次采用临床已有组胺H1受体激动剂——倍他司汀,成功逆转Olan诱发的脂代谢紊乱,并初步探明了该药物干预脂代谢紊乱的可能机制:①首先,倍他司汀结合H1R,激活AMPKα,抑制p-SREBP-1的翻译后加工剪切;②被激活的AMPKα直接磷酸化下游靶分子ACC1,这一效应可能导致产物丙二醇辅酶A合成降低,从而减除了对CPT1A分子的抑制作用;③促进PPARα和下游CPT1A的表达,增加脂肪分解。综上所述,本研究结果区分于以往细胞水平上或是非临床给药方式和剂量的动物模型研究,从模拟临床用药的整体水平上揭示了Olan引起脂代谢紊乱的分子药理机制。而倍他司汀的干预也呈现多点性特点:经肝脏上组胺H1受体,影响AMPKα、SREBP-1、PPARα等多个通路以改善血脂异常。该研究为临床上SGAs介导脂代谢紊乱的诊断性生物标志物的筛选以及干预性治疗提供了实验资料和新的研究策略。