茧丝性状是蚕业生产中非常重要的经济性状。一头多丝量实用品种的蚕可生产0.5克以上的丝蛋白,然而种质资源库中很多农家品种一头蚕的泌丝量不足0.1克。传统的育种技术是基于表型选择,而非基因型选择,效率低下,是近20年国内外家蚕育种难以突破的技术瓶颈。近年来,高通量测序技术的快速发展,推进了基因组学和功能基因组学的研究。本研究利用高通量测序技术比较分析了不同产丝量家蚕丝腺的转录组,并采用qRT-PCR技术进行了验证,挖掘调控茧丝产量的相关基因,结合家蚕基因组精细图、EST序列以及QTL定位区域的信息,发掘影响茧丝产量性状的关键功能基因。1、丝腺是家蚕丝蛋白合成的重要组织,蚕品种菁松(JS)为多丝量实用品种,而兰10(L10)为少丝量地方品种。JS的茧层量是L10的5倍左右,而L10的丝胶占茧层的比率是JS的1.2-1.3倍。我们对五龄第三天的JS和L10的丝腺进行了转录组测序,结果分析发现了1411个差异表达基因(与L10相比,在JS中有738个上调基因和673个下调基因)。GO富集分析结果表明这些差异基因主要富集在9个GO条目中。KEGG Pathway富集分析结果显示差异表达基因主要集中在与蛋白生物合成过程相关的3个通路中。我们对富集通路中的代表基因和10个差异极显著的基因进行qRT-PCR验证,验证结果与转录组测序结果一致。这一结果将有助于挖掘到调控茧丝产量相关基因。2、转录因子是细胞核内的一类蛋白因子,通过与顺式元件和RNA聚合酶的相互作用来调节转录的活性,从而间接影响蛋白的合成。在对转录组测序的结果分析时,发现部分影响蛋白生物合成相关通路的转录因子在转录水平上有较大差异。应用生物信息学的方法筛选到一些差异表达的转录因子,最终选取了trx和SGF1并利用qRT-PCR检查了它们在JS和L10在五龄期间的表达水平,,为下一步功能验证实验筛选出候选基因。3、trx基因的功能是与细胞周期和端粒、着丝粒沉默以及基因甲基化有关,我们推测trx可能是一个抑制或沉默丝蛋白基因表达的重要转录因子,该基因在L10中的表达比JS高,从而可能导致L10的丝蛋白含量少于JS。已有研究表明SGF1是丝蛋白基因通路上游的基因。我们应用CRISPR-Cas9系统和显微注射的方法,将构建的表达trx和SGF1 guide RNA的两个质粒pBac[IE1-DsRed2-U6-sgRNA],分别注射到家蚕的卵中,待到G1代产卵,获得阳性个体,饲养至G2代,与Cas9品系杂交,后代通过双荧光筛选两个转基因家蚕品系,比较了转基因的双荧光个体与野生型家蚕的全茧量与茧层量,发现无显著性差异。4、在比较差异表达基因时,我们找到了一些与丝蛋白相关基因。相关资料显示,这些基因可能位于SGF1转录因子通路的下游,为研究这些茧丝相关基因的时空表达差异,采用qRT-PCR技术,对6个重要的茧丝蛋白基因(FibH,FibL,P25,Ser1,Ser2,Ser3)在五龄期间的表达水平进行了比较分析。结果显示JS和L10,从幼虫5龄至结茧期间,FibH,FibL,P25的表达水平的变化趋势在同一品种中一致,而且在JS中的相对表达量明显高于L10。然而丝胶相对与丝素基因的表达量即Ser1/FibH的比值却是L10高于JS,与L10丝胶率比JS丝胶率高的性状是一致的。本文通过对不同产丝量家蚕品种的丝腺进行转录组测序比较分析,不但从转录组的角度鉴定出可能与茧丝产量相关的主要代谢途径,并且获得了大量丝腺差异表达基因的数据,对家蚕茧丝产量基因所富集到的相关通路有了整体的认识。这一研究将会为解析决定茧丝产量的分子机制打下基础,对于家蚕多丝量品种的选育有着重要的意义,并对家蚕丝腺生物反应器的研发具有指导作用。